1-3- هدف آزمایش…………………………………………………………………………………………………. 8

1-4-پرسش اصلی تحقیق (مساله تحقیق)……………………………………………………………………….. 9

فصل دوم: پیشینه تحقیق

2-1- حفظ انجمادی…………………………………………………………………………………………………. 11

2-1-1- کاربرد و فواید حفظ انجمادی منی…………………………………………………………………….. 11

2-1-2- انواع روش­های حفظ انجمادی…………………………………………………………………………. 12

2-1-3- تاریخچه حفظ انجماد منی قوچ ……………………………………………………………………….. 12

2-1-4- مراحل حفظ انجمادی منی……………………………………………………………………………… 14

2-2- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ………………………………………………………………………….. 15

2-2-1- رقیق کننده ها……………………………………………………………………………………………….. 15

2-2-3- مواد نگهدارنده یا محافظت کننده­ها……………………………………………………………………. 16

2-2-3-1- مواد نگهدارنده درون سلولی یا نفود کننده………………………………………………………… 16

2-2-3-2- مواد نگهدارنده برون سلولی یا نفود ناپذیر……………………………………………………….. 18

2-3-آشنایی اختصاری با سیستم آنالیز رایانه ای (CASA)…………………………………………………..

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- تجهیزات مورد نیاز برای جمع آوری، انجماد، ذوب و ذخیره منی و ارزیابی­های اسپرم………. 31

3- 2-آزمایش اول……………………………………………………………………………………………………. 31

3-3- آزمایش دوم…………………………………………………………………………………………………….. 31

3-4- حیوانات و جمع آوری منی…………………………………………………………………………………… 32

3-5- آماده سازی رقیق کننده­ها……………………………………………………………………………………. 32

3-6- رقیق سازی، انجماد و ذوب منی…………………………………………………………………………… 33

3-7- ارزیابی­های کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب…………………………………………….. 33

3-8- آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………………….. 35

فصل چهارم: نتـایج

4-1- نتایج……………………………………………………………………………………………………………… 38

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث…………………………………………………………………………………………………………….. 44

5- 2- نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………….   52

5-3- پیشنهادها ………………………………………………………………………………………………………. 54

منابع……………………………………………………………………………………………………………………… 55

چکیده:

فرایند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهش­دما به زیرصفر درجه سلسیوس، ذخیره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادی و بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث آسیب­های ساختاری و بیوشیمیایی به اسپرم می­شود که می­تواند زنده­مانی و باروری اسپرم را تحت تاثیرقرار دهد. هدف از این پژوهش، بررسی اثر سطوح مختلف لسیتین(5/0، 1، 5/1 و 2 %) و زرده تخم مرغ(10، 15، 17 و 20 %) در رقیق­کننده پایه تریس- فروکتوز (همراه با 5 درصد گلیسرول) پس­ازفرآیند انجمادو یخ‌‌گشایی بود. نمونه‌های منی توسط واژن مصنوعی از 4 راس قوچ افشاری بالغ، هفته­ای 2 بار جمع­آوری شد. نمونه­های منی رقیق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شد و سپس یخ­گشایی پایوت­های حاوی اسپرم در آب گرم 37 درجه سلسیوس انجام شد. تحرک­کل­وتحرک پیشرونده اسپرم با کمک سامانه آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازه­گیری شد. سلامت غشا، درصد اسپرم­های زنده و مورفولوژی اسپرم­ها بعد از فرایند یخ­گشایی اندازه­گیری شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که رقیق‌کننده حاوی 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ در مقایسه با سایر سطوح­های آزمایشی موجب بهبود معنی­دار­ در میزان تحرک­ کل، تحرک پیشرونده، یکپارچگی­غشا و اسپرم­های­زنده شد (01/0p < ). سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اثر معنی­داری روی مورفولوژی اسپرم­ها نداشتند (05/0p > ). مطابق با نتایج این پژوهش به نظر می‌رسد که افزودن 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ به رقیق‌کننده ­های انجماد اسپرم قوچ افشاری باعث بهبود معنی­دار فراسنجه­ های اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرم­های زنده میشود.

فصل اول: کلیات

1-1- پرورش گوسفند

پرورش گوسفند در ایران دارای قدمت تاریخی بسیار طولانی­می­باشد که هم اکنون ایران با داشتن 55 میلیون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده تولید مثلی و عدم استفاده از تلقیح مصنوعی در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادی خوبی از این صنعت به دست نیامده و رشد چندانی نکرده است. بنابراین این مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد منی قوچ با رقیق کننده­های بر پایه منشا گیاهی(لسیتین سویا) و حیوانی(زرده) برای بهبود کیفیت مناسب اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزیابی­عملکرد این رقیق کننده­ها با تست‌های­آزمایشگاهی مهم­مرتبط با توان باروری اسپرم صورت گرفت. نتیجه استفاده از این تست­ها، انتخاب رقیق کننده مناسب برای انجماد منی قوچ برای استفاده در تلقیح مصنوعی و انجام آسان برنامه­های اصلاح نژادی و در نهایت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادی بودن آن خواهد شد.

2-1- حفظ انجماد منی

حفظ انجماد منی و تلقیح مصنوعی فواید زیادی را برای صنعت پرورش حیوانات اهلی، به ویژه برای بهبود تولید مثلی و ژنتیکی­ارائه می­کنند. اما بزرگترین مانع در حفظ انجماد منی، آسیبی است که به ساختمان اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب وارد می­شود که منجر به باروری ضعیف اسپرم منجمد می­گردد (بارباس و همکاران، 2009). در طول سال­های اخیر، ابداع و توسعه­ی انواع رقیق کننده­های منی جهت انجماد اسپرم و در نتیجه افزایش راندمان و موفقیت تلقیح مصنوعی گسترش زیادی پیدا کرده است. لذا محققین مطالعات گسترده­ای برای تولید رقیق کننده­هایی که بتوانند باعث حفظ انجمادی اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترین مزایای منجمد کردن منی قوچ، می­توان به بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با استفاده از اسپرم قوچ­های با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقال­آسان منی­از مراکز تولید و جمع­آوری به دورترین دامداری­ها، انجام زایش­خارج از فصل تولید مثلی، جلوگیری از انقراض گونه­های در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، 2000).

در تحقیقات مرتبط با حفظ انجماد منی، بسیاری از مطالعات بر تشخیص آسیب­های وارد شده به اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب تمرکز نموده­اند(تریمچ و همکاران، 1997: مدیروس و همکاران، 2002). در حالی­که، مطالعات فراوان دیگری نیز به استفاده از محافظت کننده‌های مختلف در رقیق کننده منی برای جلوگیری یا کاهش این آسیب­ها، برای بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب تاکید کرده‌اند(تساک ماکدیس، 2010: فیزر و همکاران، 1984 ). بیشتر ارزیابی­های آزمایشگاهی که برای سنجش کیفیت منی استفاده می‌شود، همبستگی بالایی با توان باروری اسپرم ندارند. استفاده از رنگ­های فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری، تجزیه­و تحلیل گسترده­تری از پارامترهای اسپرم مانند زنده مانی، یکپارچگی­غشا و DNA، وضعیت آکروزوم، کروماتین­وظرفیت­دارشدن، عملکرد میتوکندری و تغییرات ساختاری (آپوپتوزیس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، 2001).

در بحث رقیق کننده منی برای جلوگیری بهتر از آسیب انجمادی[1] به کیفیت اسپرم، محافظت کننده­های انجمادی[2] مختلفی برای انجماد اسپرم در چند دهه گذشته استفاده شده است(کری و همکاران، 2000: واتسون، 1976). کیفیت اسپرم پس از ذوب، به دلیل وقوع شوک سرمایی و تنش اسمزی در طی فرآیند انجماد- ذوب کاهش می­یابد(سالامون و ویزر، 1972: بیلی و همکاران، 2000). بسیاری از این صدمات را می توان با رقیق کننده مناسب و مواد محافظ انجمادی مانع شد(گیل و همکاران، 200). ترکیبات موجود در رقیق کننده­ها باید بتوانند اسپرم را نسبت به شرایط متغیر بوجود آمده حفاظت نموده و حتی الامکان دچار صدمات کمتری کنند(هولت، 1997). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد حساسیت بالایی دارند، به طوریکه طی فرایند سرد شدن تنشی بر غشا اعمال شده که اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت.­­ در نتیجه­ی این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده که منجر به مرگ آن می‌شود(پاپا و مکاران، 2011). علاوه بر این، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود.­ بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرم با کیفیت، بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد(هولت و همکاران، 1992). رقیق کننده­های منی دارای خواص ویژه­ای هستند که موجب نگهداری طولانی تر اسپرم­ها می­شوند. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیب‌های دمایی، کاهش استرس­های فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن، انجماد-ذوب اسپرم­ها و در نهایت ایجادیک محیط مناسب برای زنده ماندن­ موقت اسپرم­ها نقش دارند(کری، 2000). گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن گلیکول دارای وزن مولکولی کم بوده و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده هستند و منابع لیپوپروتیینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زرده تخم مرغ، شیر یا لسیتین سویا برای جلوگیری از شوک سرمایی و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنی­ها مانند آنزیم­ها و آنتی بیوتیک­ها به رقیق کننده اضافه می­شود(اماموردی و همکاران، 2013). منابع حیوانی مانند زرده تخم­مرغ، یک جزء طبیعی از رقیق کننده­های منی است که غشای سلول اسپرم را در مقابل شوک سرمایی، در طول انجماد-ذوب محافظت می­کند(واتسون، 1981). مکانیسم محافظتی توسط فسفولیپیدها (لسیتین) و لیپوپروتئین­های با چگالی پایین[3] انجام می­گیرد(ویدسور و وایت، 1997: موکه و همکاران، 2008). مطالعات قبلی نشان داد که اسپرم قوچ می­تواند در برابر شوک سرمایی، با افزودن 15 درصد زرده تخم مرغ به رقیق کننده تریس محافظت شود(فیزر و همکاران، 1984). با این حال، زرده تخم مرغ ممکن است آنتاگونیست مواد محافظ انجمادی، حاوی آلودگی­های میکروبی و خطر انتقال بیماری­ها، تغییرات زیاد در ترکیبات آن­ها، دشواری مشاهدات میکروسکوپی و سبب ظرفیت دار شدن اولیه اسپرم باشد. پروتئین­های گیاهی مانند لسیتین سویا[4]، فاقد این ایرادات زرده تخم مرغ می­باشند.

در چند سال گذشته رقیق­کننده­های جدید حاوی لسیتین­سویا برای جایگزینی زرده تخم­مرغ، به طور گسترده برای انجماد منی استفاده شده است(دل واله و همکاران، 2012: گیل و همکاران، 2003: فوکویی و همکاران، 2007). در نتیجه بهبود حفظ انجماد منی، به تشخیص آسیب­های وارده به کیفیت اسپرم و استفاده از رقیق کننده منی مناسب برای جلوگیری از آسیب­های انجمادی به اسپرم را در طی فرآیند انجماد-ذوب می­طلبد.

بنابراین، هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف لسیتین سویا (5/0، 1، 5/1و 2%) و زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و20 %) و مقایسه آن­ها و انتخاب بهترین سطوح آن­ها برای استفاده در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد-ذوب می­باشد.در طول سال­های اخیر، پژوهش­های بسیاری روی بهبود حفظ انجمادی منی[5] قوچ برای گسترش تلقیح مصنوعی صورت گرفته است. بقا و تحرک اسپرم پس از انجماد–ذوب تحت تاثیر فاکتورهای متعددی از قبیل کیفیت منی، نوع و غلظت اجزای موجود در محیط انجماد منی از قبیل غلظت گلیسرول و یا سایر مواد محافظ کننده مانند منابع پروتئینی و لیپوپروتئینی است. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیب­های دمایی، کاهش استرس­های فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن و انجماد- ذوب اسپرم­ها و در نهایت ایجاد یک محیط مناسب برای حفظ کیفیت اسپرم­ نقش دارند. بنابراین استفاده از محیط انجماد مناسب منی قوچ که بتواند از اسپرم­ها در برابر آسیب­های انجماد- ذوب محافظت کند و بقا و تحرک اسپرم را بعد از انجماد- ذوب حفظ کند، گام مهمی در جهت استفاده از اسپرم منجمد در تلقیح مصنوعی گوسفند و مطالعات آزمایشگاهی است.