منجر به کاهش عملکرد این گیاه می شوند، مطالعه روی آنها ضروری به نظر رسید. بنابراین، اثر متقابل این دو بیمارگر و همچنین تنوع ژنتیکی قارچ C. coccodes و الگوی پروتئینی باکتری R. solanacearum مورد بررسی قرار گرفتند. در این تحقیق طی نمونه­برداری­های صورت گرفته در بهار، تابستان و پاییز سال 1386 تعداد70 جدایه قارچ C. coccodes و 30 استرین باکتریR. solanacearum از بوته­های آلوده جداسازی گردید که پس از شناسایی در نهایت 20 جدایه قارچ و 15 استرین باکتری برای بررسی­های بیشتر انتخاب شدند. اثر متقابل بیمارگرها با دو روش آغشته­سازی غده و خاک روی سه رقم سیب­زمینی آگریا، بورن و دیامانت مورد بررسی قرار گرفت. پارامترهای طول، وزن تر و وزن خشک ساقه و ریشه و میزان کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت قارچ اندازه­گیری شد. در هر سه رقم در حضور بیمارگرها نسبت به شاهد کاهش وزن و طول ریشه و ساقه مشاهده شد. حضور توأم R. solanacearum و C. coccodes در گیاه باعث افزایش حساسیت گیاه نسبت به آنها و کاهش بیشتر شاخص­های مورد اندازه­گیری شد. با بررسی نتایج حاصل مشخص شد که رقم آگریا حساس­ترین رقم نسبت به قارچ و باکتری است و پس از آن رقم بورن و دیامانت قرار دارند. در رقم دیامانت نسبت به باکتری مقاومت نسبی وجود دارد. روش­های آغشته­سازی غده و خاک تفاوت زیادی در ایجاد بیماری در گیاه نداشتند اما در مجموع اینوکولوم غده­زاد مخرب­تر عمل کرد. در رقم آگریا حساسیت نسبت به قارچ بیش از باکتری می­باشد. وجود باکتری به همراه قارچ توانست اثر منفی آن را روی گیاه افزایش دهد اما تفاوت بین تیمار Cc و Rs + Cc در حد معنی­داری نیست. به عبارت بهتر وجود باکتری به میزان خیلی کمی در افزایش بیماری­زایی قارچ مؤثر است. بالعکس وجود قارچ در گیاه به شدت بیماری­زایی باکتری را افزایش می­دهد. حضور توأم دو بیمارگر وزن تر ریشه را در روش آغشته­سازی خاک 39/61% و در روش آغشته­سازی غده 64/85% کاهش داد. با توجه به شاخص موجود، درصد کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت قارچ در رقم آگریا بین 50 تا 70 درصد گزارش گردید. در رقم بورن در مجموع تواناییC. coccodes و R. solanacearum در ایجاد بیماری در گیاه تقریباً به یک اندازه می­باشد. در اصل می­توان گفت که حساسیت این رقم نسبت به دو بیمارگر مشابه است. میزان کاهش صفات مورد اندازه­گیری در رقم بورن نسبت به رقم آگریا کمتر بوده و بنابراین شاید بتوان گفت که این رقم نسبت به دو بیمارگر مقاوم­تر می­باشد. کلونیزاسیون کمتر ریشه توسط میکرواسکلروت قارچ (50%) نیز مؤید این مدعا است. در رقم دیامانت در همه موارد کاهش پارامترهای گیاه نسبت به دو رقم دیگر کمتر می­باشد که نشان­دهنده مقاومت بیشتر این رقم نسبت به هر دو بیمارگر می­باشد. در اکثر موارد باکتری با تیمار شاهد از لحاظ آماری یکی شده که نشان دهنده توان بیماری­زایی کم باکتری روی این رقم و وجود مقاومت نسبی در گیاه نسبت به باکتری عامل پژمردگی می­باشد. درصد کلونیزاسیون ریشه نسبت به دو رقم دیگر کمتر بوده و حدود 30% می­باشد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی C. coccodes از نشانگر RAPD استفاده گردید. با استفاده از 10 آغازگر تصادفی تنوع ژنتیکی قابل ملاحظه­ای بین این جدایه­ها مشاهده گردید. بر این اساس، جدایه­های مختلف بر اساس ناحیه جغرافیایی از یکدیگر قابل جداسازی نبودند ولی از لحاظ ویژگی­های بیماری­زایی به خوبی از یکدیگر تفکیک شدند. همچنین به منظور مقایسه الگوی پروتئینی استرین­های باکتری پروتئین آنها استخراج و در ژل اکریل­آمید 12% الکتروفورز شد. پروتئین­ها بر اساس وزن مولکولی در یک میدان الکتریکی از یکدیگر جدا شده و پس از رنگ­آمیزی مورد مقایسه قرار گرفتند. در الگوی پروتئینی استرین­های باکتری تنوعی مشاهده نشد.

واژه­های کلیدی: برهم­کنش، رقم سیب­زمینی، RAPD، الکتروفورز پروتئین

مقدمه….1

فصل اول: بررسی منابع

1-1- باکتری Ralstonia solanacearum.. 6

    1-1-1- مقدمه. 6

    1-1-2- اسامی و موقعیت تاکسونومیکی.. 7

   1-1-3- خصوصیات… 7

    1-1-4- بیماری­زایی R. solanacearum.. 9

          الف- پلی­ساکاریدهای خارج سلولی (EPS). 10

    1-1-5- تاکسونومی  R. solanacearum.. 11

    1-1-6- علائم بیماری پژمردگی باکتریایی ناشی از R. solanacearum.. 13

          الف- روی سیب­زمینی.. 13

          ب- روی گوجه­فرنگی.. 14

          ج- روی شمعدانی.. 14

          د- روی توتون.. 14

 

    1-1-7- چرخه بیماری و اپیدمیولوژی.. 15

    1-1-8- تشخیص و شناسایی باکتری  R. solanacearum.. 16

    1-1-9- راه­های پراکنش باکتری R. solanacearum.. 17

   1-1-10- اهمیت اقتصادی بیماری پژمردگی باکتریایی سیب­زمینی.. 17

   1-1-11- میزبان­های باکتری R. solanacearum.. 18

    1-1-12- مدیریت بیماری پژمردگی باکتریایی سیب­زمینی.. 20

1-2- قارچ Colletotrichum coccodes. 24

    1-2-1- مقدمه. 24

    1-2-2- خصوصیات قارچ عامل بیماری خال سیاه سیب­زمینی.. 25

    1-2-3- تاریخچه بیماری خال سیاه سیب‌زمینی در ایران و جهان.. 26

    1-2-4- موقعیت تاکسونومیکی.. 27

    1-2-5- آلودگی و توسعه علائم.. 29

    1-2-6- علائم بیماری خال سیاه. 31

    1-2-7- جداسازی، تشخیص و شناسایی قارچ عامل بیماری خال سیاه سیب­زمینی.. 32

    1-2-8- اهمیت بیماری خال سیاه سیب­زمینی.. 33

    1-2-9- اپیدمیولوژی بیماری خال سیاه سیب­زمینی.. 34

    1-2-10- پراکنش ودامنه میزبانی بیماری خال سیاه سیب­زمینی.. 35

    1-2-11- تنوع قارچ C. coccodes. 36

    1-2-12- کنترل بیماری خال سیاه سیب­زمینی.. 38

          الف- کنترل زراعی.. 38

          ب- کنترل شیمیایی.. 39

          ج- ارقام مقاوم. 40

1-3- اثر متقابل بین دو بیمارگر. 40

1-4- بررسی­های ژنتیکی عوامل بیماری­زای گیاهی.. 44

    1-4-1- مارکرهای مولکولی.. 44

          الف- نشانگر RAPD.. 45

    1-4-2- مارکرهای بیوشیمیایی.. 45

          الف- SDS-PAGE.. 45

فصل دوم: مواد و روش­ها

2-1- نمونه برداری از مزارع آلوده سیب­زمینی.. 47

2-2- جداسازی عوامل بیماری­زای قارچی و باکتریایی از قسمت­های آلوده. 47

    2-2-1- جداسازی جدایه­های C. coccodes. 47

    2-2-2- جداسازی استرین­های باکتری R. solanacearum.. 49

2-3- خالص­سازی و نگهداری.. 49

    2-3-1- خالص­سازی و نگهداری جدایه­های C. coccodes. 49

    2-3-2- خالص­سازی و نگهداری استرین­های باکتری R. solanacearum.. 50

2-4- شناسایی.. 51

    2-4-1 – شناسایی Colletotrichum coccodes. 51

          الف- بررسی ویژگی­های ماکروسکوپی.. 51

          ب- بررسی ویژگی­های میکروسکوپی.. 51

    2-4-2- شناسایی Ralstonia solanacearum.. 52

          الف- بررسی خصوصیات فنوتیپی.. 52

2-5- تهیه محیط کشت­ها و محلول­های مورد استفاده در آزمون­های.. 53

    2-5-1- محیط پایه گلوکز- پپتون- آگار. 53

    2-5-2- محیط Ayer’s. 53

    2-5-3- محیط TTC.. 54

2-6- آزمون بیماری­زایی.. 54

    2-6-1- آزمون بیماری­زایی قارچ C. coccodes. 54

          الف- روی میوه گوجه­فرنگی.. 54

          ب- روی گیاه سیب­زمینی.. 55

    2-6-2- آزمون بیماری­زایی باکتری R. solanacearum.. 55

2-7- تهیه مایه تلقیح.. 55

    2-7-1- تهیه اینوکولوم قارچ C. coccodes. 55

    2-7-2- تهیه سوسپانسیون اسپور قارچ C. coccodes. 56

    2-7-3- تهیه سوسپانسیون باکتری R. solanacearum.. 56

2-8- بررسی­های گلخانه­ای.. 57

    2-8-1- تهیه خاک و غده سیب­زمینی.. 57

    2-8-2- كاشت غده­های سیب­زمینی و تلقیح عوامل بیماری­زا 57

          الف- اضافه کردن اینوکولوم قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum به خاک…. 57

          ب- آغشته­سازی غده­های سیب­زمینی با قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum.. 58

    2-8-3- طرح آزمایش و آنالیز نتایج حاصل.. 58

2-9- استخراج DNA ژنومی قارچ C. coccodes. 59

    2-9-1- تولید میسلیوم. 59

    2-9-2 استخراج DNA به روش لی و تیلر. 60

    2-9-3- تعیین كمیت و كیفیت DNA.. 61

2-10- نشانگر RAPD برای بررسی تنوع قارچ C. coccodes. 62

    2-10-1- تنظیم شرایط PCR.. 62

          الف- آغازگرهای واکنش RAPD.. 63

          ب- dNTPs. 64

          ج- كلرید منیزیم MgCl2 64

          د- بافر PCR (با غلظت 10 برابر). 64

          ه- آنزیم Taq DNA polymerase. 64

2-11- الكتروفورز فرآورده‌های تكثیر شده. 65

2-12- تجزیه و تحلیل داده‌های RAPD.. 65

2-13- استخراج پروتئین باکتری R. solanacearum.. 65

    2-13-1- محلول­های مورد نیاز برای استخراج پروتئین­های محلول سلولی باکتری R. solanacearum.. 66

         الف- بافر Tris-Hcl 5/1 مولار با pH: 6.8. 66

    2-13-2- تهیه بافر استخراج.. 66

2-14- الکتروفورز پروتئین­های محلول سلولی باکتری R. solanacearum.. 67

    2-14-1- تهیه ژل اکریل­آمید.. 67

          الف- ژل زیرین.. 67

          ب- ژل بالایی.. 68

    2-14-2- بافر تانک….. 68

2-15- رنگ­آمیزی ژل اکریل­آمید.. 69

    2-15-1- تهیه محلول رنگ­آمیزی.. 69

2-16- رنگ­بری ژل اکریل­آمید.. 69

    2-16-1- تهیه محلول رنگ­بر. 69

2-17- نگهداری ژل.. 69

 فصل سوم: نتایج و بحث

3-1- جداسازی و شناسایی.. 70

    3-1-1 – قارچ Colletotrichum coccodes. 70

          الف- ریخت شناسی پرگنه. 70

          ب- ویژگی­های میکروسکوپی.. 71

    3-1-2- باکتری Ralstonia solanacearum.. 73

          الف- تست­های فنوتیپی.. 73

          ب- واکنش فوق حساسیت در توتون.. 74

3-2- آزمون بیماری­زایی.. 75

    3-2-1- آزمون بیماری­زایی قارچ C. coccodes. 75

    3-2-2- آزمون بیماری­زایی باکتری R. solanacearum.. 78

3-3- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum.. 79

    3-3-1- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم آگریا 83

          الف- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ساقه سیب­زمینی رقم آگریا 83

          ب- اثرمتقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ریشه سیب­زمینی رقم آگریا 85

          ج- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ساقه سیب­زمینی رقم آگریا 86

          د- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ریشه سیب­زمینی رقم آگریا 87

          ه- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ساقه سیب­زمینی رقم آگریا 87

          و- اثر متقابل  C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ریشه سیب­زمینی رقم آگریا 88

          ز- اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت قارچ C. coccodes. 89

          ح- بحث در مورد بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم آگریا 90

    3-3-2- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم بورن.. 91

          الف- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ساقه سیب­زمینی رقم بورن.. 91

          ب- اثرمتقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ریشه سیب­زمینی رقم بورن.. 92

          ج- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ساقه سیب­زمینی رقم بورن.. 94

          د- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ریشه سیب­زمینی رقم بورن.. 95

          ه- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ساقه سیب­زمینی رقم بورن.. 96

          و- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ریشه سیب­زمینی رقم بورن.. 97

          ز- اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت C. coccodes. 98

          ح- بحث در مورد بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم بورن.. 99

    3-3-3- بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم دیامانت… 100

          الف- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ساقه سیب­زمینی رقم دیامانت… 100

          ب- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی طول ریشه سیب­زمینی رقم دیامانت… 102

          ج- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ساقه سیب­زمینی رقم دیامانت… 102

          د- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن تر ریشه سیب­زمینی رقم دیامانت… 103

          ه- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ساقه سیب­زمینی رقم دیامانت… 104

          و- اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum روی وزن خشک ریشه سیب­زمینی رقم دیامانت… 105

          ز- اثر تیمارهای مختلف روی کلونیزاسیون ریشه توسط میکرواسکلروت قارچ C. coccodes. 106

          ح- بحث در مورد بررسی اثر متقابل C. coccodes و R. solanacearum در رقم دیامانت… 106

    3-3-4- بحث کلی راجع به اثر متقابل R. solanacearum و C. coccodes در گیاه سیب­زمینی.. 107

3-4- بررسی­های ژنتیکی.. 110

    3-4-1- بررسی­های مولكولی.. 110

          الف- نشانگر RAPD.. 111

    3-4-2- بررسی­های بیوشیمیایی باکتری R. solanacearum.. 115

          الف- SDS-PAGE.. 115

3-5- پیشنهادها 117

پیوست………118

منابع… 124

مقدمه

الف- تاریخچه گیاه سیب­ زمینی

سیب­زمینی بومی امریکای جنوبی بوده و منشاء آن کشور پرو و بولیوی می­باشد و برای اولین بار حدود 7000 سال پیش در پرو کاشته شده است. بنا به باور باستان­شناسان، سیب­زمینی از حدود 2000 سال پیش از میلاد مسیح توسط اینکاها در بخش­های کوهستانی این کشور کاشته شده است. این گیاه در سال 1573 وارد اسپانیا شد و به عنوان یک منبع غذایی مورد توجه قرار گرفت و به تدریج از اسپانیا به دیگر کشورهای اروپایی برده شد. تا حدود 150 سال سیب­زمینی تنها در مناطق محدودی از اروپا در کاخ­های سلطنتی و باغچه خانه­ها کاشته می­شد. در سال 1719 از اروپا به امریکای شمالی و سپس به آسیا برده شد. تاریخچه کشت این گیاه در قاره افریقا به حدود 50 سال پیش برمی­گردد. حدود 200 سال پیش (در زمان فتحعلیشاه قاجار) مقداری بذر سیب­زمینی به ایران آورده شد. این بذرها ابتدا در یکی از روستاهای تهران کاشته شده و سپس به فریدن اصفهان و به تدریج به سایر نقاط کشور برده و کشت شد (شجاعی، 1383).

ب- مشخصات گیاه­شناسی

سیب­زمینی گیاهی دو­لپه، یکساله و از خانواده Solanaceae می­باشد. برگ­ها مرکب، گل­ها پنج قسمتی و دارای رنگ­های متفاوتی هستند. میوه­ها گرد تا تخم­مرغی (قطر 3-1 سانتی­متر یا بیشتر)، سبز رنگ، سبز متمایل به قهوه­ای یا قهوه­ای بوده و به هنگام رسیدن قرمز تا بنفش رنگ
می­شوند و حاوی بیش از 200 تا 300 بذر هستند. ساقه معمولاً سبز رنگ است اما گاهی قرمز یا بنفش، زاویه­دار، علفی و در اواخر فصل در قسمت­های پایینی نسبتاً چوبی می­شود. ریشه­ها منشعب و نیمه عمیق هستند که حداکثر عمق فعالیت آنها 60 سانتی­متر می­باشد ( هوكر[1]، 1990). لقاح در این گیاه به صورت خود­گشنی است و از لحاظ زمان رسیدن به ارقام زودرس، میان­رس و دیررس تقسیم می­شود.

اغلب گونه­هایی که به طور معمول مورد کشت قرار می­گیرند تتراپلوئید
(2n=4x=48 کروموزوم) هستند. همچنین چهار گونه دیپلوئید (24 کروموزوم)، دو گونه تریپلوئید (36 کروموزوم) و یک گونه پنتاپلوئید (60 کروموزوم) نیز گاهی مورد کشت قرار
می­گیرند. مهم­ترین گونه­ای که در سراسر جهان کشت می­شود Solanum tuberosum می­باشد که یک گونه تتراپلوئید است و دارای دو زیر گونه andigena و tuberosum می­باشد. زیر گونه andigena با طول روز کوتاه سازگاری پیدا کرده و زیر گونه tuberosum با طول روز بلند سازگار است. بررسی­های ژنتیکی نشان داده­اند که 32 رقم مورد کشت در هند از زیر گونه tuberosum به دست آمده­اند.

ج- شرایط محیطی

سیب­زمینی به طور مشخص متعلق به مناطق معتدل سرد با ارتفاع تقریبی 2000 متر یا ارتفاعات بالاتر در مناطق گرمسیری است. این گیاه به شب­های خنک و خاک دارای زهکشی مناسب و رطوبت کافی نیاز دارد و در عرض­های جغرافیایی پایین در مناطق گرم تولید خوبی ندارد (هوكر، 1990). خاک لومی- شنی حاصلخیز برای این گیاه مناسب است. دمای مناسب برای رشد 20-15 درجه سانتیگراد است و دمای بالای 29 درجه تولید غده را کاهش می­دهد. این محصول تا انتهای دوره رشد به 9-7 بار آبیاری نیاز دارد.

د- اهمیت اقتصادی و سطح زیر کشت

سیب­زمینی مهم­ترین گیاه دو­لپه­ای است که به عنوان منبع غذایی انسان­ها مورد استفاده قرار می­گیرد. این گیاه بعد از گندم، برنج و ذرت چهارمین محصول مهم غذایی در جهان است. میزان تولید ماده خشک سیب­زمینی در واحد سطح به ترتیب 04/3، 68/2 و 12/1 برابر از گندم، جو و ذرت بیشتر است. مقدار پروتئین آن نیز بیشتر از گندم، جو و ذرت می­باشد.

طبق آمار سازمان خوار و بار جهانی کشاورزی (FAO)[2] در سال 2007، میزان تولید کل
سیب­زمینی در جهان 321736483 تن گزارش شده که بیشترین سهم مربوط به چین[3] با 72040000 تن و کمترین میزان مربوط به بنین[4] با تولید 30 تن می­باشد. سهم ایران 5240000 تن می­باشد. در قاره آسیا تولید کل 135607646 تن بوده و چین و بحرین به ترتیب بیشترین و کمترین تولید را دارا هستند.

طبق گزارش آمارنامه کشاورزی ایران سطح زیر کشت، تولید و عملکرد سیب­زمینی در سال زراعی 84-83 به قرار زیر می­باشد:

عملکرد (کیلوگرم)
تولید (تن)
سطح زیر کشت (هکتار)
دیم
آبی
دیم
آبی
دیم
ﺁبی
75/5712
63/25762
59/15848
25/4814275
3/2774
5/186870
جمع    38/31475
14/4830124
8/189644
در استان همدان سطح زیر کشت سیب­زمینی 3/26517 هکتار است که تماماً به صورت آبی کاشته می­شود. میزان تولید 77/966016 تن و عملکرد 68/36429 کیلوگرم می­باشد.

ه- بیماری­های سیب­ زمینی

هر گیاهی در طول دوره رشد خود دستخوش آسیب­های مختلف ناشی از شرایط محیطی نامناسب (آب و هوا، نور، رطوبت و خاک)، حمله آفات و عوامل بیماری­زا (قارچ، باکتری، ویروس، نماتد و مایکوپلاسما) می­باشد. در واقع بیماری به برهم­کنش بین میزبان و بیمارگر گفته می­شود که تولید و قابلیت استفاده محصول را دچار مشکل می­کند. شرایط محیطی نامساعد حتی در غیاب عامل بیماری­زا به تنهایی برای صدمه به گیاه کفایت می­کند.

گیاه سیب­زمینی نیز از این آسیب­ها در امان نیست. تحت تأثیر عوامل محیطی و ژنتیکی و نوع رقم، ممکن است میزان محصول، اندازه غده­ها و بازارپسندی آنها کاهش یابد. عوامل