1-2-مقدمه، خصوصیات و کاربرد های استوباکتر ها و گلوکونوباکتر ها 3

1-3- مقدمه و کاربردهای نانوذرات نقره 3

فصل دوم مروری بر تحقیقات گذشته. 6

2-1-مقدمه. 7

2-2-تاریخچه استفاده از نانوذرات… 9

2-3-روش های تولید نانوذرات… 9

2-3-1-تولید فیزیکی.. 10

2-3-2-تولید شیمیایی.. 11

2-3-2-1- سل ـ ژل. 12

2-3-2-2- واکنش حالت‌های جامد ـ مایع. 12

2-3-2-3- چگالش فاز گازی.. 13

2-3-3-تولید بیولوژیکی.. 13

2-4- مکانیسم تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم ها 14

2-5-خواص نانوذرات فلزی نقره 21

2-6- تولید نانوذرات فلزی توسط باکتری ها 22

2-6-1-مثال هایی از تولید درون سلولی نانوذرات فلزی نقره توسط باکتریها 23

2-6-2- مثال هایی از تولید برون سلولی نانوذرات فلزی نقره توسط باکتریها 23

2-7- نانوذرات نقره 27

2-7-1- سمیت نقره 29

2-7-2- خصوصیات، مکانیسم اثر و کاربردهای نانو ذرات نقره 30

2-7-2-1- وسایل درون عروقی مصنوعی.. 33

2-7-2-2- کاتترهای قرار گرفته شده در عروق مرکزی.. 34

2-7-2-3- کاتترهای نوروسرژیکال. 34

2-7-2-4- سیمان استخوان. 35

2-7-2-5- پوشاننده های زخم. 35

2-7-2-6-مهندسی بافت… 37

2-7-2-7-درمان سرطان. 37

2-7-2-8-تشخیص پروتئین ها 37

2-8-پلیمرهای میکروبی.. 38

2-8-1-سلولز. 39

2-9-تاریخچه سلولز. 40

2-10-ویژگی های سلولز. 40

2-11-خواص سلولز. 41

2-12-تجزیه سلولز. 42

2-13-تولیدسلولز. 43

2-14-کاربردهای سلولز وانواع مشتقات آن. 45

2-14-1-مشتقات سلولز. 46

2-14-1-1-نانو بلورهای سلولز. 46

2-14-1-1-1-مشتقات Ncc. 47

2-14-1-1-2-ویژگی ها، خصوصیات و مزایای Ncc. 47

2-14-1-1-3-معایب Ncc. 48

2-14-1-2-کمپلکس سنتز سلولز. 48

فصل سوم مواد و روش ها 49

3-1- مواد و دستگاه ها 50

3-1-1- مواد شیمیایی و محیط های کشت… 50

2-1-2-دستگاه ها و وسایل.. 52

3-2- روش ها و آزمایشات… 53

3-2-1- جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آن ها 53

3-2-1-1- محیط کشت هیسترین اسکرام. 53

3-2-2-انتخاب و شناسایی سویه های باکتریایی.. 54

3-2-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 54

 

3-2-2-1-1-رنگ آمیزی گرم. 54

3-2-2-1-2- روش لام مرطوب… 55

3-2-2-1-3-رنگ آمیزی مالاشیت سبز. 55

3-2-2-1-4-آزمون کاتالاز. 55

3-2-2-1-5- آزمون اکسیداز. 55

3-2-2-1-6- آزمون حرکت، ایندول و تولید ( سولفید هیدروژن) (SIM) 56

3-2-2-1-7-آزمون ژلاتین.. 56

3-2-3-بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 56

3-2-3-1-استخراج DNA از میکروارگانیسم ها 56

3-2-3-1-1-تهیه محلول – فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل.. 56

3-2-3-2-نحوه استخراج DNA از میکروارگانیسم ها 57

3-2-3-2-1-تهیه ژل آگارز 1%. 58

3-2-3-3-پرایمرهای مورد استفاده جهت شناسایی مولکولی باکتری ها 58

3-2-3-4-واکنش زنجیره پلیمراز برای باکتری ها 59

3-2-3-5-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز. 60

3-2-4-خالص سازی سلولز تولیدی.. 60

3-2-4-1- شستشو به وسیله هیدروکسید سدیم. 61

3-2-5-تستهای تایید سلولز. 61

3-2-5-1-هضم آنزیمی.. 61

3-2-5-1-1-آزمون مولیش و بندیکت… 61

3-2-5-2-میکروسکوپ الکترونی نگاره 62

3-2-6- بررسی تولید نانوذرات نقره توسط استوباکترها و گلوکونوباکترها 62

3-2-7-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره 62

3-2-7-1- اسپکتروفوتومتری.. 62

3-2-7-2- پراش اشعه ایکس… 63

3-2-7-3- بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره 63

3-2-8- انتخاب سویه های مناسب جهت ادامه آزمون ها 63

3-2-8-1-تولید نانوذرات نقره درون بستر سلولزی به روش آر-تی.. 63

3-2-9-بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره 63

3-2-9-1-تهیه محلول استاندارد نیم مک فارلند. 64

3-2-10-نگهداری طولانی مدت سویه ها(روش گلیسرول استوک) 64

فصل چهارم نتایج و بحث… 65

4-1-جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آنها 66

4-2-شناسایی سویه های باکتریایی.. 66

4-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 66

4-2-1-1خصوصیات ماکروسکوپی.. 66

4-2-1-2- خصوصیات میکروسکوپی.. 67

4-2-1-3- لام مرطوب… 67

4-2-1-4-رنگ آمیزی مالاشیت سبز. 67

4-3- آزمونهای بیوشیمیایی.. 68

4-4- بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 68

4-4-1- استخراج DNA.. 68

4-4-2- تکثیر توالی 16SrDNA.. 69

4-4-3-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره پلیمراز. 70

4-5-نتایج خالص سازی و شستشو توسط NaOH.. 71

4-6-تستهای تاییدی سلولز. 72

4-6-1-هضم آنزیمی.. 72

4-6-1-1-آزمون مولیش و بندیکت… 72

4-6-2-بررسی میکروسکوپ الکترونی نگاره 72

4-7-بررسی تولید نانوذرات نقره توسط باکتری ها 73

4-8-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره 73

4-8-1-بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره 74

4-8-2-پراش اشعه ایکس… 74

4-8-3- بررسی اسپکتروفتومتری.. 75

4-9-تولید نانوذرات نقره در درون بستر سلولزی به روش آر-تی.. 76

4-10- بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره 76

فصل پنجم نتیجه گیری.. 78

منابع و ماخذ. 89

چکیده انگلیسی.. Error! Bookmark not defined.

چکیده

فرایند تولید سرکه به لحاظ فیزیولوژیک نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. از باکتری های تولید کننده سرکه به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر می توان اشاره نمود. این باکتری ها گرم منفی میله ای شکل و هوازی مطلق هستند. توسط تاژه های پری تریش متحرکند، رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند. استوباكترزایلینیوس،یکی از باکتریهای مولدسلولزاست. نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است. نانوذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو می باشد و به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌، کاربرد فراوان دارد. در این مطالعه، ابتدا 20 سویه از باکتری تولید کننده سلولز از سرکه جداسازی و شناسایی گردید، سپس 5 سویه جهت مطالعات بیشتر انتخاب و DNA آن ها استخراج و واکنش زنجیره پلیمراز( PCR) انجام گردید و نهایتا با استفاده از پرایمر های اختصاصی تعیین توالی شد. بعد از طی مراحل خالص سازی و تایید لایه سلولزی، تولید نانوذرات نقره توسط باکتری های فوق بررسی و سپس این 5 سویه با توانایی تولید نانوذرات نقره و سلولز تایید شد و نهایتا خواص ضد میکروبی آن ها جهت پوشانندگی زخم ها مورد بررسی قرار گرفت.

کلمات کلیدی :گلوکونوباکتر،استوباكتر، نانوذرات نقره، سلولز

فصل اول

مقدمه

1-1-مقدمه ای در مورد سرکه و تاریخچه آن

قدمت تولید سرکه حاقل به 400 سال قبل از میلاد مسیح می رسد (Deppenmeier, 2002)، و فرایند تولید آن به لحاظ فیزیولوژیک[1]نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. اولین توصیف درباره تولید سرکه توسط پاستور در سال 1862 انجام گرفت. او دریافت که مادر سرکه توده ای از ارگانیزم های زنده است که عامل اکسیداسیون اتانول به اسید استیک می باشد. باکتری های استوباکتر استی[2] و گلوکونوباکتر سابکسی[3] به ترتیب توسط Beijerink در سال 1898 و De leeuw و Kluyver در سال 1924 توصیف شدند (Moonmangmee, 2000). Asai در سال 1934 و بار دیگر در سال 1968، این باکتری ها را به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر رده بندی کرد (Higgins, 1990). این دو جنس با تغییراتی همچنان بخشی از خانواده استوباکتریاسه را با 12 جنس به خود اختصاص داده اند.

1-2-مقدمه، خصوصیات و کاربرد های استوباکتر ها و گلوکونوباکتر ها

جنس استوباکتر دارای سه گونه می باشد.باکتری گرم منفی[4] میله ای شکل و هوازی مطلق[5] است. در صورت متحرک بودن به وسیله فلاژل های پری تریش[6] متحرک اند(Brenner et al., 2005). این باکتری ها الکل را به آب و کربنیک، لاکتات را به کربنات تبدیل و بعضی از اسید های آمینه را تجزیه می کنند. استوباکترها عموماً در جو تخمیر شده، سرکه و میوه ها و سبزی های ترش یافت می شود. برخی گونه ها مانند استوباکتراستی (A.aceti) اتانول را به اسید استیک، اکسید کرده و کاربرد صنعتی در تولید سرکه دارند،به همین دلیل به استوباکترها، اسید استیک باکتری هم گفته می شوند.این باکتری ها در جوانی گرم منفی و سلول های پیر اکثراً گرم متغییراند. در زیر میکروسکوپ به شکل تک تک، دو تایی و یا به صورت زنجیره دنبال هم مشاهده می شوند. در حین تولید سرکه به هم پیچیده گاه به شکل کوکسی مانند و گاه رشته ای و بلند در می آیند. محیط اسیدی را خوب تحمل می کنند. نسبت به سودوموناس[7] ها تحرک کمتری دارند و رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند.این ارگانیسم ها را به دو گروه استوباکترهای با اکسایش شدید[8] که موقتاً ایجاد اسید استیک می نماید و آنرا دوباره تجزیه می کند و استوباکترهای با اکسایش جزئی[9] که اسید استیک تولید شده را دیگر تجزیه نمی کند،تقسیم می نمایند. از گروه استوباکترهای با اکسایش شدید می توان استوباکتر پراکسیدانس[10]، استوباکتر پاستوریانوم[11] و از استوباکترهای با اکسایش جزئی می توان گلوکونوباکتراکسیدانس[12] را نام برد. ما بین این دو گروه باکتریهای استوباکتر گزیلینوم[13] ، استوباکتر استی و استوباکتر اسیدوفیلوم[14] قرار دارند((Garrity, 2002 . این باکتری ها در صنایع غذایی جهت تولید اسید استیک و ویتامین ث اهمیت فراوانی دارند. استوباكتر زایلینیوس، یكى از باكترى هاى مولد سلولز Cellulose است و می تواند گلوكز، گلیسرول و سایر منابع آلی را به سلولز خالص تبدیل كند( and Canon, 1989 Fontana et al., 1991; Williams ). سلولز میكروبى تولید شده توسط استوباكتر زایلینیوس به عنوان یكى از با ارزش ترین پلیمر های زیستی در زمینه هاى گوناگون پزشكى كاربرد دارد.. كاربردهاى متعددى از سلولزمیكروبى در پزشكى، دامپزشكى، صنایع غذایى، نفتى،پوشاكى، آرایشی، بهداشتى و غیره شناخته شده است2001;Kobayashi et al., 2006) ., et al Klemm).

استفاده از سلولز میكروبی براى اولین بار در سال 1980،به عنوان پانسمانى پوشیده شده با مایع برای بهبود زخم انجام گرفت (Klemm et al., 2001) .فونتانا و همكارانش از سلولزمیكروبی، محصولی را با نام بیوفیلم تولید كردند و جهت سوختگی های درجه دوم و سوم، زخم های عمیق، پیوند پوست و به طور كلی برای درمان آسیب های پوستی به كار گرفتند(Fontana et al., 1991 ).

1-3- مقدمه و کاربردهای نانوذرات نقره

نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است( Narayanan and Sakthivel, 2010 ). از میان انواع مختلف نانوذرات، پرکاربردترین آن ها نانوذرات نقره است. نانو ذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو پس از نانو لوله های کربن است، که هر روزه بر کاربرد آن در دنیای نانو افزوده می شود.