3-1-2- خواص بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………………………..19

4-1-2-مقاومت در برابر عوامل فیزیكی و شیمیای…………………………………………………………………………..20

5-1-2- خواص كشت…………………………………………………………………………………………………………………20

6-1-2 شرایط رشد سالمونلاها……………………………………………………………………………………………………..21

7-1-2- بقا سالمونلا……………………………………………………………………………………………………………………22

8-1-2- زیستگاه…………………………………………………………………………………………………………………………23

2-2- تاكسونومی…………………………………………………………………………………………………………………………23

1-2-2- سالمونلا تیفی…………………………………………………………………………………………………………………26

2-2-2- سالمونلا انتریتیدیس………………………………………………………………………………………………………..26

3-2-2- سالمونلا كلراسوئیس……………………………………………………………………………………………………….27

4-2-2- سالمونلا پولوروم…………………………………………………………………………………………………………….28

5-2-2- سالمونلا گالیناروم…………………………………………………………………………………………………………..28

6-2-2- سالمونلا آریزونا……………………………………………………………………………………………………………..29

7-2-2- ساختمان آنتی­ژنی………………………………………………………………………………………………………….31

8-2-2- طبقه بندی سالمونلا به منظور اهداف اپیدمیولوژیكی………………………………………………………….32

1-8-2-2- ارگانیسم­های موجب عفونت در انسان ………………………………………………………………………..32

2-8-2-2- واریته های سرولوژیكی سازگار با میزبان………………………………………………………………………32

3-8-2-2- واریته های سرولوژیكی ناسازگار…………………………………………………………………………………33

3-2- شاخص­های بیماری­زایی……………………………………………………………………………………………………..33

1-3-2- آنتی­ژن­های سطحی………………………………………………………………………………………………………..33

2-3-2-تهاجم…………………………………………………………………………………………………………………………….33

3-3-2- اندو­توكسین انترو­توكسین سیتو­توكسین …………………………………………………………………………….34

4-2- بیماری­زایی و مكانیسم آن……………………………………………………………………………………………………34

1-4-2- روند بیماری­   زایی……………………………………………………………………………………………………………35

2-4-2- میزان شیوع سالمونلوز در انسان……………………………………………………………………………………….35

3-4-2- عفونت­های سالمونلایی در انسان……………………………………………………………………………………..36

1-3-4-2- تب تیفوئید و تب­های روده­ای……………………………………………………………………………………..36

2-3-4-2- سپتی­سمی…………………………………………………………………………………………………………………37

3-3-4-2- گاسترو­انتریت…………………………………………………………………………………………………………….37

4-4-2- علائم بالینی در انسان……………………………………………………………………………………………………..37

5-2- اپیدمیولوژی……………………………………………………………………………………………………………………….38

6-2- روش­های تشخیص…………………………………………………………………………………………………………….40

1-6-2- روش­های فنوتیپی…………………………………………………………………………………………………………..41

1-1-6-2- بیوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………..41

2-1-6-2- سروتایپینگ……………………………………………………………………………………………………………….42

3-1-6-2- روش­های ایمنولوژیك………………………………………………………………………………………………..42

1-3-1-6-2- الایزا…………………………………………………………………………………………………………………….43

2-3-1-6-2- IMS…………………………………………………………………………………………………………………..44

2-6-2- روش­های ژنوتیپی………………………………………………………………………………………………………….44

1-2-6-2- روش واكنش زنجیره ایی پلیمراز PCR)) …………………………………………………………………. 45

2-2-6-2- multiplex PCR……………………………………………………………………………………………………47

3-2-6-2- real-time PCR……………………………………………………………………………………………..47

4-2-6-2- روش تکثیر هم دمای وابسته به حلقه LAMP………………………………………………………………48

1-4-2-6-2- پرایمرهای LAMP………………………………………………………………………………………………..49

2-4-2-6-2- مكانیسم واكنش LAMP……………………………………………………………………………………….51

3-4-2-6-2- مشخصات روش LAMP………………………………………………………………………………………56

4-4-2-6-2- مواد لازم برای انجام واکنش LAMP………………………………………………………………………57

5-4-2-6-2- ارزیابی محصولات LAMP……………………………………………………………………………………60

6-4-2-6-2- مكانیسم تشكیل كدورت در واكنش LAMP…………………………………………………………….61

7-4-2-6-2- مزایای روش LAMP…………………………………………………………………………………………….62

7-2 مطالعات آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………………….63

1-7-2- مطالعه بر روی سویه­های سالمونلا به روش الایزا……………………………………………………………….63

2-7-2- مطالعه بر روی سویه­های سالمونلا به روش PCR………………………………………………………………65

3-7-2- مطالعه بر روی سویه­های سالمونلا به روش LAMP…………………………………………………………..70

فصل سوم (مواد و روش ها)…………………………………………………………………………………………………………75

1-3 وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………………76

2-3- مواد مورد استفاده ………………………………………………………………………………………………………………77

3-3- رنگ آمیزی گرم………………………………………………………………………………………………………………..79

4-3- تستهای بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………………79

1-4-3- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………….81

2-4-3- تست تریپل شوگر ایرون آگار(TSI) ………………………………………………………………………………81

3-4-3- تست SIM…………………………………………………………………………………………………………………82

4-4-3- تست اوره …………………………………………………………………………………………………………………..82

5-3- روش تهیۀ گلسیرول استوک از باکتری­ مورد نظر…………………………………………………………………..83

6-3- روش استخراج DNA ……………………………………………………………………………………………………..83

1-6-3- طرز تهیۀ محلول­های مورد نیاز برای استخراج DNA………………………………………………………..84

2-6-3- مراحل استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………84

7-3- تعیین غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر……………………………………………………………………….86

8-3- الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………..87

1-8-3- طرز تهیه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………88

2-8-3- طرز تهیۀ بافر (1X)TBE……………………………………………………………………………………………….88

9-3- واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………89

1-9-3- اجزا واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………….91

2-9-3- روش انجام واکنش PCR با آنزیم SmarTaq DNA Polymerase……………………………….93

10-3- واکنش LAMP………………………………………………………………………………………………………………94

1-10-3- روش انجام واکنشLAMP …………………………………………………………………………………………95

11-3- آلوده سازی سس مایونز با باكتری مورد نظر………………………………………………………………………..96

12-3- آلوده سازی سالاد سبزیجات با باكتری مورد نظر…………………………………………………………………..97

13-3- تهیه پورپلیت و شمارش باكتری­ها………………………………………………………………………………………98

1-13-3 تهیه رقت……………………………………………………………………………………………………………………..98

2-14-3- کشت سطحی………………………………………………………………………………………………………………99

2-14-3- کشت پورپلیت…………………………………………………………………………………………………………….99

3-13-3 شمارش باكتری­ها…………………………………………………………………………………………………………..99

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………100

1-4- رنگ آمیزی گرم از باكتری……………………………………………………………………………………………….101

2-4- نتایج کشت نمونه ها روی محیط اختصاصی shigella– salmonella agar………………………101

2-4- تست­های بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………..102

1-3-4- تست اوره………………………………………………………………………………………………………………….102

2-3-4- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………..103

3-3-4 تست TSI ……………………………………………………………………………………………………………………104

4-3-4 تست SIM……………………………………………………………………………………………………………………105

5-3-4 تست متیل رد ……………………………………………………………………………………………………………….106

4-4- استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………………….107

5-4- PCR………………………………………………………………………………………………………………………………108

1-5-4- حد تشخیص PCR………………………………………………………………………………………………………109

6-4- LAMP ……………………………………………………………………………………………………………………….110

1-6-4 حد تشخیص LAMP………………………………………………………………………………………………….112

فصل پنجم (بحث)……………………………………………………………………………………………………………………113

نتیجه­گیری………………………………………………………………………………………………………………………………..121

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………………………..122

چكیده

سالمونلا باكتری گرم منفی، متحرك و باسیلی شكل است كه خصوصیات عمومی خانواده انتروباكتریاسه را دارا می‌باشد. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی غذاهای انسانی و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری­زا در انسان­هاست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است كه برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروكولیك در انسان می‌باشند. بیماری­های ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهای در حال توسعه از جمله کشور ما می باشد. بنابراین تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن برای جلوگیری از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتری ضروری به­نظر می­رسد.

روش­های مختلفی برای جداسازی باكتری سالمونلا از نمونه‌های محیطی وجود دارد كه شامل: روش‌های كشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژیكی و مولكولی (از جمله PCR) است. تمام این روش­ها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتری در نمونه اولیه، تجهیزات گران­قیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.

هدف از این مطالعه بررسی کارایی روش نوین تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونی سالمونلا تیفی می­باشد. بررسی نتایج در تشخیص مولکولی سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشی سریع، ارزان و اختصاصی است و به­جای دستگاه­های گران­قیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با استفاده از یک بلوك حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دمای واحد 60 درجه سانتی­گراد و همچنین مشاهده کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژن­ها در زمان كوتاه­تری به تشخیص اختصاصی این باكتری سالمونلا پرداخت.

این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با كاربرد گسترده در آزمایشگاه­های تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاه­های مناطق محروم و آزمایشگاه­های سیار مورد استفاده قرار گیرد.

واژه های کلیدی : سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP

مقدمه

اعضای جنس سالمونلا، باكتری گرم منفی، میله­ایی، بی­هوازی اختیاری و بدون اسپور هستند. از آنجا كه جایگاه اصلی و طبیعی این باكتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریك می‌نامند. از لحاظ شرایط رشد این میكروارگانیسم‌ها باكتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌كنند این جنس از میكروارگانیسم‌ها به حرارت حساس‌اند. در درجه حرارت‌های پائین امكان بقای آنها بیشتر است .(Connie & Manuselis, 2000)

     اكثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باكتری‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی‌ها سیطره پیدا كرده، بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی، بیماری­هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌كنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باكتری­های روده­ایی­ هستند كه موجب بیماری تب تیفوئید(حصبه)، تب شبه حصبه و بیماری­های ناشی از مواد غذائی در انسان می­گردند(Jay et al., 2005).

     بیماری­های ناشی از آلودگی مواد غذائی ناشی از سالمونلا را non typhoidal نامیده­اند. سالمونلا به­طور گسترده­­ایی در محیط زیست از قبیل آب، خاك و مدفوع حیوانات توزیع شده است (Cidrp, 2009). باكتری معمولاً از طریق مدفوع انسان و یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می‌گردد. مواد غذائی مانند گوشت، تخم­مرغ، مرغ، سس مایونز، سبزیجات و غیره ،از ناقل­های اولیه عفونت سالمونلا به انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..

   سالمونلای غیر­تیفوئیدی علت اصلی بیماری­های ناشی از مواد غذائی در سراسر جهان است. كه بر­آورد شده كه حدود 4/1 میلیون مورد در سال مورد عفونت غذائی سالمونلا قرار می­گیرند(Mead et al., 1999).

از این­رو شناخت و تشخیص به موقع سالمونلا از اهمیت خاصی برخوردار است. با ذكر تمامی این موارد به نظر می‌رسد تشخیص به موقع و كنترل باكتری از وظایف مهم آزمایشگاه‌های میكروب‌شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باكتری می‌پردازند:

ـ روش‌های كشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.

ـ روش‌های سرولوژیكی.

ـ روش‌های مولكولی.

     برای تشخیص استفاده از روش­های سنتی مبتنی بر محیط كشت قابل قبول است ولی وقت­گیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز به­طول می­انجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوه­بر این، روش­های ایمنولوژیك مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائی سالمونلا توسه یافته­اند.

. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با این­حال اختصایت كم و هزینه­های بالا، استفاده ازین روش­ها را محدود كرده است. اخیرا روش­های مولكولی مانند PCR و real time PCR به­طور گسترده در شناسائی سالمونلا استفاده می­شوند كه روش­هایی كارآمد و حساس هستند.

Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).

     با این­حال این روش­ها نیازمند سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت­اند. از­این­رو نیاز به یك روش دقیق، حساس، آسان و به­صرفه­تر است. در سال 200 یك گروه ژاپنی یك روش تشخیص مولكولی به نام LAMP را معرفی كردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یك روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژن­های ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یك روش ساده، بدون نیاز به سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).

     هدف این تحقیق شناسائی باكتری سالمونلا تیفی در سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با استفاده از روش LAMP، به­عنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی می­باشد.

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی

طراحی و بهینه­سازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
مقایسه دو روش PCR و LAM
مشخصات جنس سالمونلا
1-1-2- تاریخچه

در سال 1885 یك دامپزشك آمریكائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باكتری را از خوك جدا كرد وآن را باسیلوس كلرا­سوئیس[1] نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی كه در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آن­را باسیلوس انتریتیدیس نامید كه بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد. در سال 1900 خواص این باكتری توسط فردی به نام لینیر به­طور رسمی تصویب گردید. از آنجا كه این ارگانیسم ها شبیه به باكتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار كاشف اولیه این باكتری سالمونلا[2] نامیدند(Roumagnac et al., 2006).

     در فاصله بین سال­های 1925ـ1900 بزرگ­ترین رویداد در كشف سرولوژیكی آنتی‌ژن‌های سوماتیك و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 تركیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول كافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .

     سالمونلا بطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاك حاوی مدفوع حیوانات و غیره. به طور عمده این باكتری­ها در روده­ی حیوانات ساكن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).

 2-1-2- خواص شكلی

اعضای جنس سالمونلا باكتری­های میله­ای شكل و اندازه­ی آن 5-2 ´5/1-7 /. میكرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانواده­ی انتروباكتریاسه­اند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اكثر اعضای این جنس متحرك و با تاژه­ی پری­تریش­اند به­جز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گالیناروم[3] و سالمونلا پولوروم[4] (et al., 2005 Hara-Kudo).

3-1-2- خواص بیوشیمیایی

اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوكز بوده ولی از تخمیر ساكارز و لاكتوز نا­توانند. بیشتر انواع سالمونلا ها گلوكز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دكسترین و سوربیتول را تخمیر می كنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اكثر سویه­ها H2sرا از منبع سولفوری معدنی تولید كرده و تولید H2S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیص سالمونلاها می­باشد. به استثنای سروتیپ تیفی[5] در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد می­کنند. در سیترات به عنوان تنها منبع كربن رشد می­كنند اما برخی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باكتری اكسیداز منفی و كاتالاز مثبت بوده. از تولیدات این باكتری لیزین در كربوكسیلات، سولفات هیدروژن وارنیتین می‌باشد.

( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .

   از دیگر ویژگیهای بیوشیمیایی این است كه اكثر سالمونلاها عدم تولید اندول، عدم تولید آنزیم‌های اوره آز،   لیپاز، دزاكسی ریبونوكلئاز، فنیل‌آلانین و تریپتوفان دآمیناز، دكربوكسیلاسیون اسیدهای آمینه لیزین، اورنیتین و آرژنین، واكنش مثبت در آزمایش متیل‌رد(MR) و واكنش منفی در آزمایش وژس ـ پروسكوئر (VP) مثبت می‌باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

 4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فیزیكی و شیمیایی

این باكتری روی محیط كشت ماهها زنده می­مانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقیقه تحمل می­كنند، سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشه­های آلوده نگهداری شده در یخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاك باغچه و مدت بسیار طولانی در شیرخشك­های بدون چربی و موادغذایی دارای تخم مرغ زنده می­مانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و یخ زنده مانده واز این طریق می­توانند اپیدمی به­وجود آورند. كلرامنفیكل استرپتومیسین و بسیاری از آنتی بیوتیك های وسیع الطیف بر آن موثرند پنی سیلین بر آن كاملا بی­اثر است. سالمونلاها همچنین نسبت به املاح صفراوی مقاومند وبه همین دلیل از این مواد نیز علاوه بر رنگ­ها در تهیه محیط‌های غنی‌كننده استفاده می‌كنند Aksoy, 2004)).

 5-1-2- خواص كشت

اعضای این جنس هوازی بی­هوازی اختیاری می­باشند. مزوفیل بوده و رشد بهینه­ی آن در دمای 37درجه است.با این­حال برخی از سالمونلا­هادر شرایط شدید زیست محیطی مانند درجه حرارت بالای 54 درجه و سرمای 4-2 درجه را تحمل كنند. pH مناسب برای رشد آن 5/7-5/ 6 می باشد ولی pH حدود 9- 5/4  را می تواند تحمل كند و اگر pH پائین­تر از 4 برود باعث از بین رفتن میكرو­ارگانیسم می­شود. pH بیشتر از 9 صرفا از رشد آن جلوگیری می­كند. غلظت نمك 3/ 5 % بالاتر عاملی در جهت جلوگیری از رشد و تكثیر باکتری است (Jay et al., 2005 ; Doyle.M, 2007).

     اکثر سالمونلاها در روی آگار مغذی بعد از 24 ساعت پرگنه هایی به قطر 3-2 میلی متر و به رنگ سفید، خاکستری، مرطوب ،کروی، مسطح، برجسته و صاف ایجاد می کنند.