1-1-3 تاریخچه لیشمانیوز در ایران……………………………………………………………. 8
1-2 رده­بندی و طبقه­بندی انگل لیشمانیا…………………………………………………… 9
1-3 مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا……………………………………………… 11
1-3-1-1 مورفولوژی انگل……………………………………………………………………… 11
1-3-1-2 شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)…………………………………. 11
1-3-1-3 شکل تاژک دار (پروماستیگوت)…………………………………………………….. 12
1-3-2-1 سیر تکاملی انگل……………………………………………………………………. 15
1-3-2-2 سیر تكاملی انگل در بدن حشره…………………………………………………… 15
1-3-2-3 پشه خاكی……………………………………………………………………………. 15
1-3-2-4 سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار…………………………………………. 16
1-4 راههای انتقال لیشمانیا به انسان……………………………………………………….. 18
1-4-1 انتقال از طریق نیش پشه خاکی………………………………………………………. 19
1-4-2 انتقال مکانیکی…………………………………………………………………………. 19
1-4-3 انتقال از راه خون……………………………………………………………………….. 19
1-4-4 انتقال مستقیم…………………………………………………………………………… 19
1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………. 20
1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا………………………………………………………….. 19
1-5-2 لیشمانیوز احشایی……………………………………………………………………….. 20
1-5-3 لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…………………………………………….. 21
1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………… 22
1-5-3-2 لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………….. 22
1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب…………………………………………………………….. 22
1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………….. 23
1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………. 24
1-5-3-5 لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………. 24
1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا……………………………………………………………… 25
1-6-1 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی………………………………………… 25
1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………….. 25
1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…………………………………………… 26
1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………….. 26
1-6-1-3 عملکرد T-CELL……………………………………………………………………….
1-6-2 مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی………………………………………. 28
1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار…………………………………………………………. 28
1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………… 28
1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD+4……………………………………………………..
1-7 روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………. 30
1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل………………………………………………………. 30
1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………. 31
1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………….. 31
1-7-1-2 کشت انگل……………………………………………………………………………….. 32
1-7-2 روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل…………………………………………………. 32
1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………… 32
1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی……………………………… 33
1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………… 33
1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)…………………………………… 34
1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……………………………………………….. 35
1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………… 35
1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………….
فصل دوم : مروری بر متون گذشته
فصل سوم: مواد و روشها
3-1کشت انگل………………………………………………………………………………………. 43
3 -1-1 مواد مورد نیاز جهت كشت انگل………………………………………………………….. 43
3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………….. 43
3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌…………………………………………………
3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل………………………………………………………………….. 44
3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………………….
3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………………………..
3-1-7. روش كشت انگل……………………………………………………………………………. 45
3-1-8. روش شمارش سلولها………………………………………………………………………. 46
3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل………………………………………………… 46
3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار……………………………………………………………………… 46
3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay……………………………………………….
3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………………….
3-2-2. مراحل Limiting dilution assay…………………………………………………………
3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………….. 50
3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………… 50
3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…. 52
3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )……………………….. 53
3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………….. 53
3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………. 54
3-5-3 مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE………………………………………………..
3-5-4 آماده­سازی   نمونه………………………………………………………………………….. 57
3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود…………………………………………………………………………. 57
3-5-7. روش انجام SDS-PAGE…………………………………………………………………….
3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250…………………………………………………
مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:………………………………………………..
3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………………..
3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford……………………………………………..
3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………. 61
3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………………………..
3-7-1 روش انجام تست L.T.T………………………………………………………………….
1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T………………………………………..
3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………. 66
3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………….. 67
3-8-2 نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………… 67
3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………..
3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………….
3-9-2 مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………. 69
3-9-3 نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………….
فصل چهارم: نتایج
4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution………………………
4-2 بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها…………………………………………… 72
4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford………………………………..
4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………………………
4-4-1 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B…………………………………………….
4-4-2 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C…………………………………………….
4-4-3. نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………….
4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)……………………… 76
4-4-5. بررسی نتایج حاصل از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A
4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………….
4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی………………………………. 79
4-5-1 نتایج تست DTH 24 ساعته………………………………………………………… 79
4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته……………………………………………………………. 82
4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته………………………………………………………… 83
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
منابع……………………………………………………………………………………………… 95
خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………….. 106
خلاصه فارسی:
مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.
هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی
روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­ کلون­ های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.
نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون