دکتر فرهاد نظریان فیروزآبادی
مهندس سیده زهرا حسینی
 
 
پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد
در رشته بیوتکنولوژی
 
بهمن 93
 

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

فهرست مطالب                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                            شماره صفحه

1 فصل اول

1-1 مقدمه 2

2 فصل دوم

2-1 کلیات 7

2-1-1                       اهمیت گیاهان دارویی 7

2-1-2                             متابولیت‌های ثانویه گیاهی 7

2-1-3    اهمیت پزشکی و دارویی متابولیت‌های ثانویه 9

2-2 زیست فناوری و تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی 9

2-2-1                                                کشت بافت و تولید متابولیت‌های ثانویه 9

2-2-2          کشت سلولی 10

2-2-3                                  کشت ریشه‌های موئین 11

2-2-4                مهندسی متابولیک 12

2-2-5                زیست فناوری و A. rhizogenes 14

2-3   آگروباکتری رایزوژنز 15

2-3-1                                                                       مکانیسم برهم کنش آگروباکتری و سلول گیاهی 16

2-3-2               طبقه بندی ناقل‌های Ri 17

2-3-3               ژن‌های T-DNA ناقل Ri 18

2-3-4                                                                                                                                            ژن‌های Rol 19

2-3-5               باززایی گیاه كامل از ریشه‌های موئین 19

2-4      خصوصیات گیاه‌شناسی گیاه شقایق 20

2-4-1                                                     مسیرهای بیوسنتز آلکالوئیدهای گیاه شقایق 20

2-4-2                                     آلکالوئیدهای گیاه شقایق 22

2-5      سابقه پژوهش 24

3 فصل سوم

3-1 همسانه‌سازی 30

3-1-1          مواد گیاهی 30

3-1-2               سویه‌های باکتری 30

3-1-3                                                                                                                                             آغازگرها 30

3-1-4                          میزبان‌های همسانه‌سازی 31

3-1-5                                             محیط کشت باکتری و آنتی بیوتیک‌ها 34

3-1-6                   آنزیم‌های محدودگر 34

3-2 روش‌ها 35

3-2-1                                      شناسایی، جداسازی و تکثیر ژن 4′OMT 35

3-2-2                          همسانه‌سازی توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 37

3-2-3                                                                              ساخت cDNAی جهت تکثیر ژن 4′OMT 40

3-2-4                   تکثیر cDNAی ژن 4′OMT و همسانه‌سازی در ناقل pTZ57R/T 41

3-2-5                                           همسانه‌سازی سازه‌ی فوق بیانی ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285 44

3-2-6                                                       تأیید مجدد سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM 46

3-3   کشت بافت و انتقال ژن 48

3-3-1                                                              بهینه‌سازی شرایط القای ریشه‌های موئین 48

3-3-2                                                                                                                                                کشت بذر 49

3-3-3                                                                                                 محیط‌های تلقیح و هم کشتی 50

3-3-4                         تلقیح و دوره هم کشتی 50

3-3-5                                           انتقال ریزنمونه‌ها به محیط گزینشگر 50

3-3-6                         استخراج DNA از ریشه‌های موئین و طبیعی گیاه شقایق 51

3-3-7                                                                                                                                          واکنش PCR 51

3-4 انتقال سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به آگروباکتری رایزوژنز 52

 

3-4-1                                انتقال سازه‌ی فوق بیانی ژن 4′OMT به آگروباکتری رایزوژنز 53

3-4-2                                                          انتقال سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به ریشه‌های موئین 53

3-4-3                              انتقال سازه‌ی فوق بیان ژن 4′OMT به ریشه‌های موئین گیاه شقایق 53

3-4-4                                                               آنالیز تراریزش ریشه‌های موئین با سازه خاموشی diox 54

3-4-5                                                                                                                  PCR در زمان واقعی 54

4 فصل چهارم

4-1 نتایج همسانه‌سازی 57

4-1-1                        تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT و تأیید آن با هضم آنزیمی 57

4-1-2          تأیید همسانه‌سازی توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 58

4-1-3                                                         نتایج بررسی بیوانفورماتیکی توالی ژنومی ژن 4′OMT 60

4-1-4                              تأیید همسانه‌سازی cDNA ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 64

4-1-5                        تأیید همسانه‌سازی ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285 66

4-1-6                                 تأیید مجدد سازه‌ی خاموشی diox با هضم آنزیمی 68

4-2   نتایج کشت بافت و انتقال ژن 69

4-2-1          نتایج بهینه‌سازی القای ریشه موئین 69

4-2-2                          درصد القای ریشه موئین 71

4-2-3                 تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یک سانتی‌متر 77

4-2-4                                   تعداد ریشه موئین در ریزنمونه 78

4-2-5                                                           روند تولید ریشه موئین برای سویه‌های مختلف 79

4-2-6                                            بررسی تراریختی ریشه‌های موئین با PCR 81

4-2-7                                 تأیید انتقال سازه‌ی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز 82

4-2-8                                                                            نتایج تایید تراریزش سازه خاموشی در ریشه‌های موئین با PCR 84

4-2-9          نتایج آنالیز PCRدر زمان واقعی 85

4-3   پیشنهادات 90

منابع       91

پیوست‌ها                                        100

فهرست اشکال                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                      شماره صفحه

شکل ‏2‑1: مکانیسم مولکولی خاموشی پس از رونویسی (Borgio, 2009)… 14

شکل ‏2‑2: شکل شماتیک نقشه ژنی ناقل Ri نوع مانوپین A. rhizogenes (Ozyigit et al., 2013).   17

شکل ‏2‑3: شکل شماتیک نقشه ژنی ناقل Ri نوع آگروپین A. rhizogenes (Ozyigit et al., 2013).   18

شکل ‏2‑4: مسیر سنتز آلکالوئیدهای مختلف در گیاه شقایق (Beaudoin and Facchini, 2014).   22

شکل ‏3‑1: ساختار ناقل همسانه‌سازی pTZ57R/T… 32

شکل ‏3‑2: ناقل اختصاصی pGSA1285… 33

شکل ‏3‑3 : دیاگرام سازه‌ی فوق بیانی ژن 4′OMT… 44

شکل ‏3‑4: مشابهت توالی دو ژن T6ODM و CODM و قطعه خاموشی. ناحیه مشترک دو ژن به رنگ طوسی و ناحیه قرمز رنگ مربوط به ناحیه ترجمه نشدنی انتهای ′3 ژن‌ها است. ناحیه سیز رنگ با نام DIOX-a نشان دهنده قطعه خاموشی است… 46

شکل ‏3‑5 : دیاگرام سازه خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM در ناقل pGSA1285.   47

شکل ‏4‑1: گرادیان دمایی جهت تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT در گیاه شقایق. چاهکkb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی، چاهک‌های 1 تا 7 به ترتیب دماهای اتصال: 2/47، 6/47، 7/49، 51، 8/53، 1/56 و 4/57 درجه سانتی‌گراد… 57

شکل ‏4‑2: هضم محصول PCR ژن 4′OMT با آنزیم HindIII. Kb1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1: قطعات برش خورده ژن 4′OMT، چاهک 2: محصول PCR برش نخورده ژن 4′OMT… 58

شکل ‏4‑3 : تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu، چاهک 1Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- :کنترل منفی، چاهک‌های 4-1: نمونه‌های تکثیری… 59

شکل ‏4‑4 : کلنی PCR برای تأیید حضور توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T. چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت، چاهک‌های 1-22: کلنی‌های انتخابی… 59

شکل ‏4‑5 : هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT با آنزیم‌های NcoI و PmlI. چاهک 1: ناقل T/A برش نخورده حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT، چاهک‌های 2-5: ناقل T/A برش خورده حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT و خروج قطعه ژنومی ژن 4′OMT… 60

شکل ‏4‑6 : نتیجه توالی‌یابی، توالی ژنومی ژن 4′OMT، رنگ سبز نشان دهنده توالی اینترون ژن 4′OMT و به طول bp 114 است… 61

شکل ‏4‑7 : همردیفی توالی ژنومی جداسازی شده 4’OMT با توالی موجود در Genbank در بردارنده توالی اینترون. در این شکل توالی اینترونی در ناحیه 844 تا bp 859 قرار دارد.   62

شکل ‏4‑8 : دومین‌های عملکردی موجود در ساختار پروتئین 4’OMT.. 63

شکل ‏4‑9 : توالی اسیدآمینه مربوط به دومین‌های عملکردی موجود در ساختار ژن 4’OMT.   63

شکل ‏4‑10 : همردیفی توالی پروتئین 4′OMT موجود در Genbank با توالی همسانه‌سازی شده.   64

شکل ‏4‑11 : تکثیر توالی cDNA ژن 4′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu، چاهک 1Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی، چاهک C+ : کنترل مثبت (توالی ژنومی ژن 4′OMT)، چاهک 1-4: محصول PCR حاصل از تکثیر ژن 4′OMT به طول bp 1074… 64

شکل ‏4‑12: کلنی PCR برای تأیید حضور توالی cDNAی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T. چاهک 1-21: کلنی‌های مورد بررسی، چاهک C- : کنترل منفی، C+: کنترل مثبت (DNA ژنومی) چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی… 65

شکل ‏4‑13: هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی cDNAی ژن 4′OMT با آنزیم‌های XhoI و SpeI. چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1 : مربوط به ناقل T/A برش نخورده حاوی cDNAی ژن 4′OMT، چاهک 2 تا 6: ناقل T/A برش خورده و خارج شدن ژن 4′OMT… 65

شکل ‏4‑14: نتیجه توالی‌یابی همسانه‌سازی توالی cDNA ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T.   66

شکل ‏4‑15: کلنی PCR برای تأیید حضور ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285. چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل T/A حاوی ژن 4′OMT)، چاهک‌های 1-7: کلنی‌های انتخابی… 67

شکل ‏4‑16: هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 حاوی cDNAی ژن 4′OMT با آنزیم‌های XhoI و SpeI. چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1 : ناقل pGSA1285 برش نخورده حاوی cDNAی ژن 4′OMT، چاهک 2 و 3: ناقل pGSA1285 برش خورده و خارج شدن ژن 4′OMT… 68

شکل ‏4‑17: هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 جهت تأیید سازه‌ی خاموشی diox با آنزیم‌های AscI و SpeI. چاهک 1Kb: نشانگر وزن مولکولی، چاهک 1: برش ناقل pGSA1285 و خارج شدن سازه خاموشی diox، چاهک 2: ناقل برش نخورده pGSA1285 حاوی سازه‌ی خاموشی diox… 69

شکل ‏4‑18: توسعه ریشه موئین در گیاه شقایق بعد از تلقیح با Agrobacterium rhizogenes . A، B و C ریزنمونه اندام هوایی، به ترتیب 8، 16 و 24 روز بعد از تلقیح، D : ریزنمونه هیپوکوتیل، 12 روز بعد از تلقیح… 71

شکل ‏4‑19: اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 72

شکل ‏4‑20: اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه‌ هیپوکوتیل در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 75

شکل ‏4‑21: اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یک سانتی‌متر برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 78

شکل ‏4‑22: اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد ریشه موئین در ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند… 79

شکل ‏4‑23: روند تولید ریشه‌های موئین (در ریزنمونه اندام هوایی) برای سویه‌های آگروباکتری رایزوژنز در روزهای 8، 12، 16، 20 و 24 (DAI). در محیط MS و دمای 17 و 25 درجه سانتی‌گراد به ترتیب (الف و ب)، در محیط ½ MS و دمای 17 و 25 درجه سانتی‌گراد به ترتیب (ج و د)… 80

شکل ‏4‑24 : نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشه‌های موئین با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی ژن rolB در گیاه شقایق. چاهک100 bp : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی (ریشه‌های معمولی)، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل Ri از A. rhizogenes)، چاهک‌های 1 تا10: ریشه‌های موئین تراریخته… 81

شکل ‏4‑25: نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشه‌های موئین با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی ژن rolC در گیاه شقایق. چاهک bp100: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی (ریشه‌های معمولی)، چاهک C+ : کنترل مثبت (ناقل Ri از A. rhizogenes)، چاهک‌های 1 تا10: ریشه‌های موئین تراریخته… 82

شکل ‏4‑26: کلنی-PCR برای تأیید حضور سازه‌ی خاموشی diox در آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC15834. چاهک 100 bp: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل pGSA1285 حاوی سازه خاموشی diox)، چاهک‌های 1 تا 6: کلنی-PCR‌های آگروباکتری رایزوژنز… 83

شکل ‏4‑27 : تأیید انتقال سازه‌ی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC 15834 با PCR. bp 100 : نشانگر وزن مولکولی، 1C- : کنترل منفی (آب)، 2C- : کنترل منفی (باکتری E.coli بدون سازه)، 1C+ : کنترل مثبت (ناقل pGSA1285 حاوی سازه خاموشی diox)، 2C+ : کنترل مثبت (باکتری E.coli حاوی سازه خاموشی diox)، 1 و 2: نمونه‌های تکثیری با آغازگرهای pGSA-F و nptII-R1… 83

شکل ‏4‑28: ظهور ریشه‌‌های موئین روی ریزنمونه‌ی اندام هوایی در گیاه شقایق، سه هفته پس از تلقیح با آگروباکتری رایزوژنز سویه‌ی ATCC15834 حاوی سازه خاموشی مشترک Diox.   84

شکل ‏4‑29: قسمت الف، ب و ج) به ترتیب تکثیر اختصاصی ژن‌های rolB، rolC و virG در کلون‌های ریشه موئین. چاهک bp 100: نشانگر وزن مولکولی، چاهک -C : کنترل منفی، چاهک C+ : کنترل مثبت (ناقل ATCC15834)، چاهک 1-20: کلون‌های ریشه موئین. د) چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک -C : کنترل منفی، چاهک 1-20: کلون‌های ریشه موئین جهت بررسی وجود سازه خاموشی diox… 85

شکل ‏4‑30 : منحنی جذب فلورسنت نمونه‌های مورد آنالیز، خط افقی قرمز رنگ، نشان دهنده حدآستانه (Threshold) می‌باشد که محل تقاطع آن با هر کدام از منحنی‌ها شاخص CT تعیین شد.   86

شکل ‏4‑31 : نمایش منحنی ذوب نمونه‌های مورد آنالیز مربوط به ژن T6ODM (پیک‌های سمت چپ) و ELF1 (پیک‌های سمت راست)، پیک‌های که در دمای پائین‌تر هستند نشان دهنده قطعات کوچکتر هستند… 87

شکل ‏4‑32: میزان بیان ژن T6ODM در کلون‌های ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox (2) در مقایسه با ریشه های موئین شاهد (1)… 88

شکل ‏4‑33: میزان بیان ژن CODM در کلون‌های ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox (2) در مقایسه با ریشه های موئین شاهد (1)… 88

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          شماره صفحه

جدول ‏3‑1: آغازگرهای رفت و برگشتی مورد استفاده.. 31

جدول ‏3‑2 : آنتی بیوتیک‌ها و غلظت‌های مورد استفاده.. 34

جدول ‏3‑3: آنزیم‌های برشی محدودگر مورد استفاده.. 34

جدول ‏3‑4: محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT.. 36

جدول ‏3‑5: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT   36

جدول ‏3‑6 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با آنزیم HindIII. 37

جدول ‏3‑7: محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu… 38

جدول ‏3‑8: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu. 38

جدول ‏3‑9 : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژنومی ژن 4′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T.. 39

جدول ‏3‑10 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم NcoI و PmlI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 40

جدول ‏3‑11: اجزای ترکیب ساخت cDNA جهت تکثیر ژن 4′OMT… 41

جدول ‏3‑12 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر cDNAی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu.   42

جدول ‏3‑13 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر cDNAی ژن 4′OMT با بهره گرفتن از آنزیم pfu. 42

جدول ‏3‑14 : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق cDNAی ژن 4′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T   43

جدول ‏3‑15 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoI و SpeI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 43

جدول ‏3‑16 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoIو SpeI مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 45

جدول ‏3‑17: اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژن 4′OMT به داخل ناقل pGSA1285.   45

جدول ‏3‑18 : محتویات واکنش PCR برای تأیید سازه‌ی خاموشی Diox… 47

جدول ‏3‑19: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تأیید سازه‌ی خاموشی Diox.   48

جدول ‏3‑20 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم AscI و SpeI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد… 48

جدول ‏3‑21 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر ژن‌های rolB و rolC… 52

جدول ‏3‑22 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر ژن‌های rolB و rolC.   52

جدول ‏3‑23: اجزای واکنش Real-time PCR برای بررسی بیان ژن‌های T6ODM و CODM.   54

جدول ‏4‑1: نتایج تجزیه واریانس برای صفات مورد بررسی در ریزنمونه اندام هوایی و هیپوکوتیل.. 70

 

 

 

 

1      فصل اول
 

مقدمه

 

1-1       مقدمه
سابقه استفاده از گیاهان دارویی برای سلامت انسان به تاریخ باستانی بشر باز می‌گردد. به‌طوری ‌که حتی در کتب قدیمی مانند انجیل و کتاب مقدس باستانی هند  (ودا(، استفاده از برخی گیاهان در درمان بیماری‌ها توصیه شده است. اولین سند مکتوب از استفاده از گیاهان دارویی را می‌توان در پاپیروس ابرس[1] (1800 سال قبل از میلاد مسیح) یافت. اما قدمت استفاده از گیاهان دارویی، به‌‌ معنی روند رو به کاهش آن در دنیای مدرن امروزی نیست. امروزه در جوامع صنعتی و در بسیاری از کشورهای پیشرفته و درحال توسعه، استفاده از طب سنتی و گیاهان دارویی برای حفظ سلامتی، به‌دلیل افزایش اعتماد مردم به استفاده از این گیاهان، بسیار چشمگیر است. گیاهان دارویی مهم‌ترین منبع از داروها برای مردم در سراسر جهان هستند (Tripathi and Tripathi, 2003).

طبق برآوردی که توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) صورت گرفته است، بیش از 80 درصد مردم جهان (نزدیک به 5 میلیارد نفر)‌، برای درمان بیماری‌ها هنوز از داروهای گیاهی استفاده می‌کنند. تقریباً یک چهارم داروهای تهیه ‌شده‌ی دنیا دارای منشأ گیاهی هستند که یا مستقیماً از گیاهان عصاره‌گیری شده‌اند و یا بر اساس ترکیب گیاهی،‌ تلفیق و سنتز شده‌اند. کار بر روی طب سنتی و استفاده از گیاهان دارویی، در سراسر جهان و به ‌خصوص هند، ژاپن، پاکستان، سریلانکا و تایلند در دست انجام می‌باشد. در اروپا و در کشورهایی از قبیل آلبانی، بلغارستان، کرواسی، فرانسه، آلمان، مجارستان، هلند، اسپانیا و انگلستان و همچنین ترکیه، حدود 1500 گونه از گیاهان دارویی و معطر مورد استفاده قرار گرفته و در حدود 14700 محصول گیاهی در اروپا و ایالات متحده تولید می‌شود. در حدود 25 درصد از داروهای تجویز شده در ایالات متحده، حاوی حداقل یک ترکیب فعال گیاهی هستند. در چین، فروش داروهای سنتی در طول 5 سال اخیر دو برابر شده است. در هند نیز صادرات گیاهان دارویی نسبت به سال‌های قبل سه برابر شده است. تعداد زیادی از فرآورده‌های دارویی مشهور از گیاهان بدست می‌آیند. به‌طور کلی تقاضای جهانی برای داروهای گیاهی در حال رشد است (Arfin Khan et al., 2009).

گیاهان عالی‌ترین طراحان و تولیدکنندگان انواع ترکیبات کوچک هستند که به‌عنوان مواد غذایی، داروها و مواد خام صنعتی برای انسان سودمند می‌باشند. اغلب برخی از گیاهان دارویی برای درمان برخی از بیماری‌ها با بهره گرفتن از روش آزمون و خطا شناخته شده‌اند. تنها کمتر از 200 سال پیش جداسازی اولین جزء شیمیایی فعال (متابولیت ثانویه)، مسئول اثر دارویی آن رخ داده است. امروز، بسیاری از ترکیبات مشتق شده از گیاهان در صنعت داروسازی استفاده می‌شود و همچنین گیاهان نیز به‌عنوان یک منبع مهم برای ترکیبات جدید به بشر خدمت می‌کنند (Häkkinen et al., 2013).

گیاه شقایق با نام علمی Papaver somniferum L. متعلق به خانواده Papaveraceae می‌باشد. شقایق گیاهی دیپلوئید است (2n=22). آلکالوئیدهای شقایق (به ‌غیر ازThebaine ، Cryptopine و Protopine) در هیچ جنس گیاهی به غیر از papaver وجود ندارد. که این مسئله اهمیت گیاه شقایق را به‌عنوان تنها منبع آلکالوئیدهای گروه مورفین ( مورفین، تبائین، کدوئین، نارکوتین و …) روشن می‌کند (Tetenyi, 1997).

خواص دارویی این گیاه به ‌قدری بی‌نظیر است که شقایق به‌عنوان مهم‌ترین گیاه دارویی در دنیا شناخته شده است. این گیاه تعداد زیادی آلکالوئید بنزیل ایزوکوئینولین مختلف را تولید می‌کند که برخی از آن‌ها نظیر مورفین ضددرد، کدوئین و پاپاورین به‌عنوان شل کننده عضلات، نوسکاپین به‌عنوان داروی ضد تومور و سنگوی‌نارین به‌عنوان ضد میکروبی از نظر پزشکی دارای اهمیت می‌باشند (Di Fiore et al., 2004).

سطح زیر کشت این گیاه رو به افزایش است به‌طوری که بر طبق برآوردهای موجود، سطح زیر کشت غیرقانونی این گیاه در سال 2013 در دنیا به‌میزان 296720 هکتار رسید که بالاترین سطح زیرکشت از سال 1998 بوده است (United Nations Office on Drugs and Crime, 2014).

افزایش ارزش انرژی و نیروی کار از یک طرف و لزوم کنترل دقیق مزارع کشت این گیاه به‌جهت جلوگیری از سو استفاده و قاچاق از طرف دیگر کشورهای مختلف دنیا را به این فکر واداشت تا به‌فکر استحصال مستقیم آلکالوئید در واحد سطح باشند تا ضمن کاهش سطح زیر کشت، با صرف هزینه و نیروی انسانس کمتر، محصول بیشتری بدست آورند. همچنین محققین علم زیست فناوری در تلاش هستند که آلکالوئیدهای دارویی و پزشکی گیاه شقایق را در شرایط آزمایشگاهی تولید و بدست آورند. این مسئله از این جهت حائز اهمیت است که اگر بتوانند این ترکیبات دارویی را از روشی غیر از روش کشت سنتی بدست آورند تا حدودی از سو استفاده و قاچاق این گیاه دارویی جلوگیری می‌نمایند و یا از میزان خسارت‌های اجتماعی آن کاسته خواهد شد.

تولید متابولیت‌های ثانویه در درون شیشه از طریق کشت بافت‌های گیاهی امکان پذیر است. مواردی وجود دارد که میزان متابولیت‌های موجود در سلول‌های کشت بافت شده خیلی بیشتر از میزان آن در گیاه کامل است و یا حتی سلول‌های کشت بافت شده، متابولیت‌هایی تولید می‌کنند که در گیاه اولیه تولید نمی‌شود. با توجه به آنکه در طبیعت سرعت تولید متابولیت‌های ثانویه آهسته بوده و مدت زمان طولانی برای تولید لازم است، بنابراین میزان تولید اقتصادی نبوده و ضروری به نظر می‌رسد که برای تولید سریع و انبوه متابولیت‌های ثانویه و مواد دارویی، از فنون کشت بافت گیاهی به‌طور بهینه استفاده شود. کشت بافت گیاهی یکی از مهم‌ترین تکنیک‌ها در راستای تولید صنعتی متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی است، زیرا پتانسیل این مواد در شرایط طبیعی بسیار محدود می‌باشد. برخی مزیت‌های تولید متابولیت‌های ثانویه از طریق کشت بافت شامل کنترل بهینه شرایط کشت، افزودن پیش سازهای موردنیاز برای افزایش بازده و تولید متابولیت‌های ثانویه خاص می‌باشد (Hu and Min, 2006). اخیراً هدف صنعت آن است كه تكنیك‌های كشت درون شیشه ای گیاهی را آن چنان توسعه دهد كه تولید متابولیت‌های ثانویه نسبت به استحصال آن‌ها از گیاه كامل یا سنتز آزمایشگاهی ارزان تر شود. بزرگ‌ترین چالش موجود در این زمینه این است كه متابولیت‌های مزبور در مرحله خاصی تولید می‌شوند و بعضی از تركیبات چنانچه سلول تمایز نیابد، سنتز نمی‌شوند. بنابراین، در برخی موارد كشت سلولهای گیاهی تمایز نیافته، توان بیوسنتزی فراورده‌های ثانویه را از دست می‌دهند. با توجه به نتایج بدست آمده از كشت بافت‌های تمایز یافته بیشتر پژوهش‌ها بر كشت ریشه‌های موئین[2] تاكید دارند (Hu and Min, 2006).

ریشه مویین نوعی بیماری گیاهی است كه توسط یك باكتری گرم منفی خاكزی به‌نام آگروباكتری رایزوژنز (Agrobacterium rhizogenes) ایجاد می‌شود. زمانی‌كه باكتری وارد گیاه می‌شود، تعدادی از ژن‌ها از پلاسمید باكتری، به گیاه منتقل شده و وارد ژنوم هسته‌ای گیاه میزبان می‌شود. حاصل این انتقال تولید ریشه موئین در نزدیكی جایگاه ورود باكتری است (Sevon and Caldentey, 2002)

تکنولوژی‌های نوین کشت بافت شامل کشت ریشه‌های موئین در جهت استحصال متابولیت‌های ثانویه دارای محاسنی هستند که توجه این محققین را به‌خود جلب کرده است. شاخصه‌ی ریشه‌های موئین ناشی از A. rhizogenes، شامل رشد سریع ریشه‌ها و شاخه‌های زیاد با تراکم بیوماس بالا بر روی یک محیط عاری از فیتوهورمون است. این ریشه‌های پایدار، به‌دلیل ثبات ژنتیکی و بیوشیمیایی ذاتی، متابولیت‌های ثانویه را در طی یک دوره طولانی تولید می‌کنند (Majumdar et al., 2011).

کشت ریشه‌های موئین تراریخته یک سیستم مدل مفید جهت بررسی بیوسنتز آلکالوئیدها و دیگر متابولیت‌های ثانویه متنوع است (Rostampour et al., 2009b). تولید ریشه‌های موئین با واسطه آگروباکتری رایزوژنز یک ابزار سریع و ساده را برای معرفی و بیان ژن‌های خارجی در سلول‌های گیاهی به‌وجود می‌آورد که قادر به سنتز متابولیت‌های ثانویه‌ی ویژه هستند. این رویکرد برای تغییر تجمع آلکالوئیدهای تولید شده‌ی به‌طور طبیعی در ریشه‌ها است (Park and Facchini, 2000).

امروزه مهندسی متابولیک، روشی خاص برای تنظیم بیوسنتز آلکالوئیدها و دستکاری فرآورده‌های متابولیکی است که می‌توان سطح مسیرهای با ارزش میانه یا فرآورده‌های انتهایی را به وسیله تشدید بیان از یک آنزیم با سرعت محدود افزایش دهد و یا اینکه متابولیت‌های نامطلوب را از طریق خاموشی ژن از بین برده یا کاهش داد (Frick et al., 2007). مهندسی متابولیک از طریق تغییر در فعالیت آنزیم‌های بیوسنتزی، یا پروتئین‌های تنظیمی مسئول در بیان ژن‌های مسیر، تغییرات در مقدار یا ساختار شیمیایی متابولیت‌های خاص را ایجاد می‌کند (Larkin et al., 2007). در روش مهندسی متابولیت می‌توان با وارد نمودن ژن مربوط به آنزیم‌های کلیدی و قرار دادن آن‌ها در کنار پیشبرهای قوی، بیان ژن را افزایش داد. از طرف دیگر با بهره گرفتن از روش‌های خاموشی ژن، این امکان وجود دارد تا از طریق مهار تولید این آنزیم‌ها، راه متابولیکی را به‌سمت محصول مورد نظر نشانه‌گیری کرد (حسینی و همکاران، 1378).

تاکنون مطالعات معدودی روی ریشه موئین در گیاه شقایق صورت گرفته است (Le Flem-Bonhomme et al., 2004; Park and Facchini, 2000; Yoshimatsu and Shimomura, 1992) پس لازم است مطالعات گسترده‌تری جهت بهینه‌سازی شرایط القای ریشه موئین در این گیاه صورت گیرد. بر این اساس این تحقیق به‌منظور دستیابی به دستورالعمل مناسب و با راندمان بالا جهت القای ریشه‌های موئین در گیاه P. somniferum طراحی گردید. همچنین به‌دلیل اهمیت متابولیت‌های ثانویه‌ی این گیاه، تأثیر تشدید بیان ژن 4′OMT و خاموشی همزمان دو ژن T6ODM و CODM روی میزان آلکالوئیدهای ریشه‌‌ موئین گیاه شقایق مورد بررسی قرار گرفت. قابل ذکر است که این تحقیق، اولین گزارش از مهندسی متابولیک ژن‌های مسیرهای آلکالوئیدی در ریشه‌های موئین گیاه شقایق در دنیا است.