بوریک می تواند نقش مفیدی بر سلامت سلول های مزانشیم و تمایز آنها به استئوبلاست داشته باشد.

کلید واژه­ها: سلول ­های بنیادی مزانشیم مغز استخوان، اسید بوریک، قابلیت حیات، آنزیم­های متابولیکی، تمایز

 
فصل اول: کلیات و هدف
1
1-1  سلول­های بنیادی ………………………………………………………………………
1
1-1- 1 تعریف سلول­های بنیادی…………………………………………..
2
1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی…………………….
3
1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ……………………………………………………….
4
1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا ……………………………………………………..
4
1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی…………………………………………………
6
1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف………………………………………..
7
1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان………………………..
10
1-1-5 سلول­های مغز استخوان ……………………………….
10
1-1-5-1 سلول­های بنیادی خونساز…………………………..
11
1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان……………………………..
12
1-2  تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ………………………………..
13
1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم …………………………..
14
1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………..
15
1-2-3 ویژگی­های اساسی سلول بنیادی مزانشیم …………………….
16
1-3  کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ………………..
17
1-3-1 ترمیم استخوان ……………………………………………….
17
1-4 بافت استخوان ……………………………………………..
20
1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) ……………………………..
21
1-5-1 استخوان­سازی اولیه یا جنینی ………………………..
23
1-5-2 استخوان­سازی ثانویه ………………………………………………..
23
1-5-3 دوباره­سازی استخوان …………………………………………..
24
1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ……………..
25
1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ………………………………………………
25
1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول‌های بنیادی مزانشیمی ……………………………………………..
27
1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان …………………………
29
1-7 عنصر بور ……………………………………..
30
1-7-1 مشتقات بور ………………………………………………………..
32
1-7-2 فراوانی عنصر بور ………………………………………
32
1-7-3 تاریخچه مصرف بور ………………………………..
33
1-7-4 منابع طبیعی بور…………………………………
34
1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران ………………………………………….
34
1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن …………………………………..
36
1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها ……………………………………………………..
37
1-7-6 کاربرد بور در دارو ………………………………………………
37
1-7-7 سرطان ……………………………………………………….
39
1-8 اثرات بور روی استخوان …………………………………….
40
1-9 بور و خون ………………………………………………………..
41
1-10 بور در گیاهان …………………………………………………………
42
1-11 سمیت بور …………………………………………….
44
1-12 محدوده استفاده بور ………………………………………………
45
مروری بر مطالعات گذشته ………………………………………
47
هدف مطالعه ……………………………………………………………..
 
 
 
فصل دوم: مواد و روش­ها
50
2-1  انتخاب رت ……………………………………………………………….
50
2-2 جدا سازی وتكثیر سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………..
52
2-2-1 اجرای پاساژ ………………………………
54
2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ……………………………………….
54
2-3-1 تمایز به استخوان …………………………………………………………….
55
2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ………………………………
55
2-4-1  رنگ آمیزی تریپان بلو ………………………………………………..
57
2-4-2  سنجش تترازولیوم (MTT) …………………………………………………….
57
2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر   استئوژنیک( …………………………………………………………………..
58
2-4-2-2  ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم …………………………………………………
59
2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک …………………….
60
2-5  انتخاب دوز مورد نظر ………………………………………..
60
2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم …………….
61
2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ………………………………
63
2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ………………..
62
2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت ……………………………………………..
65
2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ………………………………………….
65
2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ………………………………
65
2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ………………………………………
66
2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری …………………………………….
66
2-8-2-2 ترانس آمینازها …………………………………
68
2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز…………………………………
70
2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ………………………………………………
72
2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک
72
2-8-3-1  رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ………………………..
73
2-8-3-2  بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده …………………………………
73
2-8-4  بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( …………………….
73
2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی …………
74
2-8-4-1-1 مراحل  انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( …………………………..
75
2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه­گیری میزان کلسیم …..
76
2-8-4-2 اندازه­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک …………………………..
81
2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها …………..
 
 
 
فصل سوم: نتایج
82
3-1 الف: نتایج مرحله اول …………………………………
82
3-1-1  رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ……………………
82
3-1-2  اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ……………………
85
3-1-3  بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ………………
87
3-1-4  نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول ……………………………………………..
89
3-1-5  اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ……
91
3-1-6  میزان الکترولیتها…………………………………………..
92
3-2  نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست …………………………..
92
3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ………………………..
93
3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­های  استئوژنیک
96
3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ………………………………..
97
3-2-3-1  میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ………………………………………………..
100
3-2-3-2  میزان رسوب کلسیم ……………………………………..
101
3-2-3-3  بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز ………….
101
3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ………………………………………………………..
103
3-2-3-5  بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ………………..
103
3-2-3-6  بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………
 
  

 
 
فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری
105
4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ………………………..
105
4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها ……………………………………………………
108
4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی …………………………………………………………………
109
4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ….
113
4-1-4  اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ………………………………………
116
4-2  اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ………………………………
116
4-2-1 توانایی زیستی …………………………………….
119
4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها …………………………………………….
120
4-2-3  بررسی فاکتورهای استئوژنیک …………………….
124
4-2-4  بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی …………..
127
4-2-5  تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ……………………………………………..
128
4-3  نتیجه گیری ………………………………………………………
129
4-4 پیشنهادات …………………………………………………………….
 
 
 
فصل پنجم:ضمیمه
131
5-1 روش تهیه محیط کشت ………………………………………………….
131
5-2  تهیه ی فسفات بافر سالین PBS– …………………………….
132
5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+………………………
132
5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک …………………………..
133
5-5  آماده سازی آلیزارین رد ……………………………………………
133
5-6  روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد …………………………….
133
5-7  تهیه کریستال ویولت ………………………………………
133
5-8 روش تهیه محلول   MTT………………………………….
133
5-9  روش تهیه بافر شست و شو(  ( Tris-Hcl-NaCl…………………..
133
5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر  استخراج ( Tris-Hcl) …………
134
5-11 روش تهیه بافر ARS ……………….
134
5-12 روش تهیه محلول BSA ……………………………
134
5-13   روش تهیه محلول کمپلکس لاوری …………
135
5-14  روش تهیه بافر استخراج کلسیم ………………………….
135
5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ….
تعریف سلول­های بنیادی

   به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1).

سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های تمایزیافته می‌باشند (شکل 1-1)(1).

به دلیل این­که این سلول­ها منشا تولید بقیه انواع سلول­ها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار می­رود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلول­های تخصص یافته را دارد. این سلول­ها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. قاعدتاً یک سلول بنیادی تا قبل از دریافت یک سیگنال جهت تکامل به سلول تخصصی به صورت غیرتخصصی باقی می­ماند. سلول­های بنیادی در بدن انسان ویژگی تمایز به بسیاری از سلول­ها را دارند. همچنین به عنوان سیستم ترمیم به خدمت گرفته می­شوند زیرا که توانایی تقسیم بدون محدودیت برای جایگزینی دیگر سلول­ها را دارا می­باشند. وقتی یک سلول بنیادی تقسیم می­شود هر سلول جدید بدست آمده این پتانسیل را دارد که سلول بنیادی باقی بماند یا به سلول تخصصی جدید مثل سلول­های خونی و … تمایز یابد (1).

شکل1-1: توانائی خودنوزائی و  پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.Cellingbiosciences.Com)
 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی

   تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلول­ها در تولید نسخه­های یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلول­های دختری عینا شبیه سلول­های مادری باقی می­ماند.

خودتجدیدی سلول­ها بنیادی تحت تاثیر سیگنال­های درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنال­های درونی، خودتجدیدی سلول­های بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز می­باشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلول­های بنیادی باقی می­مانند یا متمایز می­شوند (2).

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آن­ها:

   سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:

الف) همه توان[4]: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلول­ها می­توان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلول­های بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول‌ها می‌توانند به انواع سلول‌های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند.

ب) پر توان[5]: این نوع سلول­ها قادر به ساخت غالب یا همه سلول­های فرد هستند. به عنوان مثال سلول­های بنیادی جنینی تحت شرایط خاص می­توانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلول­های جفت نیستند. سلول‌های بنیادی جنینی و سلول‌های پر توان القایی جز این دسته از سلول‌های بنیادی می‌باشند.

پ)چند توان[6]: سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول‌ تمایز پیدا می­‌کنند (در بافت­های بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).

ت) یک توان[7]: توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کرده­اند. مانند سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2) (3).

شکل 1-2: دسته­بندی سلول­های بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا