سلولهای سرتولی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….4.

سلولهای ژرمینال………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5.

اسپرماتوسیت اولیه………………………………………………………………………………………………………………………………………………..5.

سلولهای بنیادی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 5.

اسپرماتوگونی(گونه ای از سلولهای بنیادی در انسان)…………………………………………………………………………………………………..8.

سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در موش……………………………………………………………………………………………………………………9.

رده سلولی رده سلولی GC1-spg …………………………………………………………………………………………………………………………10.

محیط کشت مناسب برای GC1-spg……………………………………………………………………………………………………………………..10.

رده سلولی SFTF-PI43…………………………………………………………………………………………………………………………………….11.

محیط کشت مناسب برای SFTF-PI43…………………………………………………………………………………………………………………11.

ناباروری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..11.

ناباروری در جنس مذکر……………………………………………………………………………………………………………………………………..12.

ناباروری در جنس مونث……………………………………………………………………………………………………………………………………. 12.

عوامل ایجاد کننده ناباروری:

الف- ژنتیکی: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..13.

ب- شرایط محیطی:……………………………………………………………………………………………………………………………………………13.

تاثیر سموم بر روی باروری…………………………………………………………………………………………………………………………………..14.

سموم گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..15.

گوسیپول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….16.

بررسی تاثیرات گوسیپول بر روی حیوانات وانسان…………………………………………………………………………………………………….20.

سمیت عمومی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………20.

اثر گوسیپول بر روی حیوانات……………………………………………………………………………………………………………………………….21.

1- نشخوارکنندگان:

الف- گاو…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………21.

ب- گوسفند……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..22.

2- غیرنشخوارکنندگان:

الف- خوک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..22.

ب- خرگوش…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23.

 

ج- سگ…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24.

د- ماهی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………24.

جدید ترین یافته ها از اثرات گوسیپول……………………………………………………………………………………………………………………25.

تاثیر گوسیپول بر روی انسان…………………………………………………………………………………………………………………………………26.

کشت سلول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26.

پیشینه تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..27.

فصل دوم: روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………..31.

مواد

تهیه رده های سلولی……………………………………………………………………………………………………………………………………………32.

شرایط نگهداری رده های سلولی………………………………………………………………………………………………………………………….32.

محیط کشت RPMI-1640……………………………………………………………………………………………………………………………….32.

سرم جنینی گاو (fbs)…………………………………………………………………………………………………………………………………………33.

Pbs………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..33.

Penstrep………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..34.

DMSO………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….34.

Trypsin EDTA…………………………………………………………………………………………………………………………………………….35.

Trypan Blue sain…………………………………………………………………………………………………………………………………………35.

روش کار

پاساژ سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………36.

ساخت محیط کشت کامل……………………………………………………………………………………………………………………………………38.

چگونگی تهیهBack up …………………………………………………………………………………………………………………………………….39.

احیای سلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 39.

کاشت رده سلولی:

1- تعیین زمان دو بررابر شدن سلولی……………………………………………………………………………………………………………………..39.

2- کاشت­رده­سلولی­در پلیت 24 خانه…………………………………………………………………………………………………………………….41.

تهیه محلول گوسیپول………………………………………………………………………………………………………………………………………….42.

بررسی سمیت سلولی…………………………………………………………………………………………………………………………………………..43.

تعیین سمیت گوسیپول به روش آزمون MTT…………………………………………………………………………………………………………43.

آزمون MTT……………………………………………………………………………………………………………………………………………………44.

بررسی سمیت با بهره گرفتن از تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………..47.

روش آماری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48.

فصل سوم: یافته ها

بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی GC1-spg با تست MTT……………………………………………………………………………..50.

بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی SFTF-pI43با تست MTT……………………………………………………………………………52.

بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی GC1-spgو SFTF-pI43با تست تریپان بلو…………………………………………………….55.

شمارش سلولی برای تخمین زمان دو برابر شدن ………………………………………………………………………………………………………60.

IC50گوسیپول در دو رده سلولی………………………………………………………………………………………………………………………….61.

فصل چهارم: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………62.

بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………….63.

فصل پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..70.

مشکلات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..71.

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72.

تقدیر وتشکر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..73.

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 74.

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….87.

 فهرست جداول

جدول شماره 1-3 : نتایج آزمون MTT پس از مجاورت رده های سلولی GC1-spg با غلظتهای مختلف گوسیپول……………50.

جدول شماره 2-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول در با گروه کنترل در رده سلولی GC1-SPG توسط آزمونMTT……..51.

جدول شماره 3-3 : نتایج آزمون MTT پس از مجاورت رده های سلولی SFTF-pI43 با غلظتهای مختلف گوسیپول…………53.

جدول شماره4 -3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول رده سلولی SFTF-pI43توسط آزمونMTT …………..54.

جدول شماره 5-3 : میانگین درصد حیات سلول های SFTF-PI43و GC1-SPG پس از مجاورت با گوسیپول به روش رنگ‌آمیزی تریپان بلو…………………………………………………………………………………………………………………………………………56.

جدول شماره 6-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپولرده سلولی GC1-SPG با بهره گرفتن از روش رنگ آمیزی تریپان بلو………………………………………………………………………………………………………………………………………………..57.

جدول شماره 7-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول با گروه کنترل در رده سلولی SFTF-pI43 با بهره گرفتن از روش رنگ آمیزی تریپان بلو………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….59.

فهرست نمودارها

نمودار شماره 1-3 : درصدحیات سلولهای GC1-spg در مجاورت باغلظتهای توسط آزمون MTT…………………………………..52.

نمودار شماره 2-3 : در صد حیات سلولهای SFTF-PI43 در مجاورت با غلظتهای گوسیپول توسط آزمون MTT…………………55.

نمودار شماره 3-3 : در صد حیات سلولهای GC1-spgپس از مجاورت با غلظتهای گوسیپول به روش تریپان بلو…………………58.

نمودار شماره 4-3 : درصد حیات سلولهای SFTF-PI43 پس از مجاورت با غلضتهای گوسیپول بهروش آزمون تریپان بلو…….60.

نمودار شماره 5-3 : نحوه محاسبه زمان تقریبی دوبرابر شدن رده سلولی GC1-spg…………………………………………………………60.

نمودار شماره 6-3 : نحوه محاسبه زمان دو برابر شدن در رده سلولی SFTF-PI43…………………………………………………………..61.

نمودار شماره 7-3 : تعیین IC50گوسیپول توسط آزمون MTT در دو رده سلولی…………………………………………………………..61.

فهرست تصاویر

تصویر شماره 1-1 : طرحی از تکثیر اسپرماتوگونی ها و بازسازی سلولهای بنیادی در جوندگان……………………………………10.

تصویر شماره 2-1 :گیاه پنبه دانه……………………………………………………………………………………………………………………….16.

تصویر شماره 3-1 : ساختار گوسیپول…………………………………………………………………………………………………………………18.

تصویر شماره 1-2 : نمایی از سلولهای GS1-spg………………………………………………………………………………………………..37.

تصویر شماره 2-2 : نمایی از سلولهای، SFTF-PI43 …………………………………………………………………………………………..37.

تصویر شماره 3-2 : نحوه کشت سلولها در پلیتهای 24 خانه……………………………………………………………………………………41.  

تصویر شماره 4-2 : پودر گوسیپول استیک اسید   ……………………………………………………………………………………………….43.    

تصویر شماره 5-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول……………………………………………………………………………………………………43.

تصویر شماره 6-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول برای انجام آزمون MTT ……………………………………………………………….46.

تصویر شماره 7-2 : اضافه شدن MTT بعد از24 ساعت به چاهکهای پلیت……………………………………………………………….46.

چكیده

 ارزیابی سمیت گوسیپول بر روی دو رده سلول های بنیادی بافت بیضه

 سابقه وهدف:

گوسیپول یک ترکیب پلی فنلی استخراج شده از گیاه پنبه دانه است. در حال حاضر این گیاه به عنوان مکمل غذایی برای تغذیه نشخوار کنندگان استفاده می شود. بعضی از مطالعات حاکی از آن است که مصرف بیش از اندازه گوسیپول، باعث اختلال در فرآیند اسپرماتوژنزیس می شود. با توجه به اینکه ممکن است این ماده بر روی سلولهای ژرمینال تاثیر بگذارد، لذا در این پژوهش، به بررسی اثر آن بر روی دو رده سلول بنیادی بافت بیضه موش GC1-spg (حیوان غیرنشخوار کننده ) و بافت بیضه گوسفند SFTF-PI43 (حیوان نشخوار کننده) پرداخته شد.

روش کار:

سلولهای GC1-spg و SFTF-PI43، در محیط کشت RPMI1640 به همراه 10%  FBSو همچنین پنی سیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. سپس از هر رده سلولی، تعداد 104x5 سلول در چاهک های دو پلیت 24 خانه کاشته شد. پس از تهیه محلول گوسیپول اسید استیک در 4 غلظت 25/1، 5/2، 5 و 10 میکرومولار به مدت 24ساعت با رده­های سلولی ذکر شده مجاورت پیدا کرده و انکوبه شدند. به منظور بررسی اثر گوسیپول استیک اسید بر روی رشد سلولها، از روش MTT asseyو همچنین جهت بررسی حیات سلولی از روش رنگ آمیزی Trypan Blue استفاده گردید. آنالیز داده­ ها توسط آزمون یک طرفه ANOVA و T-Test با بهره گرفتن از نرم افزار SPSS انجام شد.

یافته­ ها:

در این مطالعه، میزان سمیت گوسیپول، در غلضتهای 5/2، 5 و 10 میکرومولار نسبت به گروه کنترل، در هر دو رده سلولی دیده شد، که از نظر آماری معنی دار بود (P<oo1). میزان سمیت گوسیپول در غلظت 25/1 میکرومولار، از نظر آماری معنی دار نبود.

نتیجه گیری:

اثر سمیت گوسیپول استیک اسید بر روی دو رده سلولی بافت بیضه GC1-spg , SFTF-PI43))، حاکی از کاهش توانایی حیات سلولهای بنیادی در روند اسپرماتوژنزیس بوده که وابسته به دوز است.

واژه­ های­ کلیدی: گوسیپول، توکسیسیتی، GC1-spg ، SFTF-PI43 ، بافت بیضه .                          

 بیضه:

بیضه، دارای یک کپسول ضخیمی است، که توسط بافت همبند متراکمی به نام تونیکا آلبوژینه آ، احاطه شده است. همچنین یک کیسه سروزی از خارج آن را احاطه کرده است که تونیکا واژینالیس نام دارد. بیضه شامل 250 بخش هرمی به نام لوبول های بیضه بوده که در هر لوبول 1 تا 4 عدد لوله پیچ دار یا لوله های اسپرم ساز[1] در آن وجود دارد. در بین این لوله ها بافت ظریفی وجود دارد که شامل عروق خونی، لنفاوی و اعصاب و تعدادی سلول به نام سلول بینابینی (لایدیگ) است. کار مهم این سلول ها، تولید هورمون تستوسترون یا آندرروژن می باشد (6).

 سلولهای سرتولی:

سلولهای مهم دیگری در عمل کرد بیضه وجود دارند که نقش پشتیبانی،حفاظت و تغذیه اسپرماتوزوئیدهای در حال تکامل را به عهده می­گیرند، این سلولها را سرتولی می نامند. این سلولها، طویل و هرمی شکل بوده که قاعده آنها بر روی غشای پایه لوله اسپرم ساز و رأسشان تا مجرای لوله امتداد یافته است. سلولهای سرتولی دارای هسته ای مثلثی شکل و سیتوپلاسمی نامنظم و تعداد زیادی میتوکندری، لیزوزوم و شبکه آندوپلاسمی صاف و خشن می­باشد. این سلولها به وسیله اتصالات شکافدار به هم متصل هستند که سبب ایجاد ارتباط یونی وشیمیایی بین این سلولها می­شود. سلولهای سرتولی در برابر شرایط نامطلوب همانند عفونت و یا قرارگیری در معرض پرتو x نسبت به سلولهای رده اسپرماتوژن، مقاومترند (6و70).

سلولهای ژرمینال :

بر روی غشای پایه لوله­های اسپرم ساز 8- 4 طبقه سلول جنسی قرار داشته که کارشان تولید اسپرماتوزوئیدها است. این­ روند را اسپرماتوژنزیس می­نامند که شامل تقسیم میتوزی، میوزی و تمایز نهایی اسپرماتیدها است (70).

اسپرماتویست اولیه :

سلولهای زایای اولیه به سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تبدیل شده و از اجتماع سلولهای بنیادی، سلولهایی برای ساختن اسپرماتوگونی A که ایجاد آن به طور مشخص آغازگر اسپرماتوژنز میباشد به وجود می­آید. سلولهای A در ادامه با تقسیمات میتوزی خود تبدیل به اسپرماتوگونی B شده و این نوع اسپرماتوگونی به اسپرماتوسیت­های اولیه تقسیم می­شوند (70).

اسپرماتویست ثانویه نیز از اسپرماتویست اولیه توسط تقسیم میوزی شکل می­گیرد و در نهایت از اسپرماتوسیت ثانویه، اسپرماتید به وجود می آید (6) .

سلول بنیادی:

سلولهای بنیادی سلولهایی­اند که دو ویژگی مهم یعنی توانایی تقسیم و تولید سلولها با ویژگی یکسان (خودنوزایی[2]) را دارند. این سلولها هنگامی که تقسیم می­شوند، می­توانند سلولهای تخصصی و تمایز یافته ای را ایجاد کنند (85). خود نوزایی سلولهای بنیادی، از اساسی­ترین ویژگی­هایی هستند، که این سلولها آن را کسب می­نمایند. این سلول ها ازطریق تقسیم میتوزی تکثیر یافته و تمام سلولهای دختری به وجود آمده، دقیقا شبیه به سلولهای مادری خود هستند (4و53).

تقسیم در این نوع سلولها، به دو روش متقارن و نامتقارن صورت می­پذیرد. در تقسیم متقارن شرایط به این صورت است که دو سلول دختری کاملا شبیه به سلول مادری بوده و تا زمانی که شرایط تمایز برای آن وجود داشته باشد، تقسیم ادامه می­یابد. در تقسیم نامتقارن نیز هر سلول بنیادی به یک سلول بنیادی که ویژگی­های خود نوزایی دارد و همچنین یک سلول پیش ساز که به یک سلول تخصص یافته تبدیل شده است، تقسیم می­شوند. با فراهم شدن شرایط تمایز، سلول پیش ساز متمایز می­گردد (13 و53).

این سلولهای بنیادی را می­توان به انواع همه توان، پرتوان و چند توان تقسیم نمود. همه توان، سلولهایی هستند که قادرند همه سلول ها اعم از سلول های خود فرد و یا سلولهای