معنی­دار نبود اما بین رقم تکدانه تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک اختلاف معنی­داری در روز 15 و 20 مشاهده گردید. با توجه به این نتایج، می­توان نقش اسید آبسیزیک را در ایجاد تغییرات کیفی و همچنین تاثیر بر روند پیری میوه­ها، مورد توجه قرار داد. در بخش بیوتکنولوژی، ژن آلفامانوزیداز (یک ژن مرتبط با پیری) برای اولین بار، در پنج رقم مختلف گیلاس شناسایی و تعیین توالی شد. به این منظور، آغازگرهای رفت و برگشت ژن مورد نظر از طریق مراجعه به پایگاه داده NCBI و استفاده از توالی­های مربوط به ژن آلفامانوزیداز برای هلو و فلفل، با استفاده از کپی کامل cDNA هلو و فلفل طراحی شد. به علت زیاد بودن طول ژن سه جفت آغازگر طراحی شد گه این آغازگرها قادرند طول 3100 جفت­باز را پوشش دهند. همچنین دمای اتصال آغازگرها با استفاده از برنامه گرادیانت PCR بدست آمد. بعد از استخراج DNA ارقام گیلاس، یک قسمت از ژن مذکور تکثیر، توالی­یابی (با استفاده از نرم­افزار سنگر) و همردیف­سازی توالی­ها انجام شد و نمودار دندروگرام مربوط به آن با استفاده از نرم‌افزار 3 View رسم گردید. بررسی و مقایسه توالی­های معکوس، شباهت و تفاوت­هایی را در ارقام مختلف نشان داد که بر طبق آن ارقام پیش­رس (ER)، پیش­رس خارجی (FE) و دیررس (LR) دارای شباهت بیشتر بوده و در یک گروه قرار گرفتند. ارقام پیش­رس قزوین (GH) و دوم­رس (MR) دارای تفاوت بیشتری نسبت به سه رقم اول بوده و با یکدیگر نیز تفاوت نشان داده و هرکدام به طور جداگانه یک گروه مجزا را تشکیل دادند.این تفاوت­ها می­توانند در عملکرد ژن و در نتیجه رفتار گیاه تاثیرگذار باشند. به عنوان مثال، با مطالعات بیشتر و استفاده از تکنیک­های مهندسی ژنتیک، می­توان علت زمان­های متفاوت رسیدگی و تفاوت در طول عمر انبارمانی موجود در ارقام مختلف گیلاس را در این اختلاف توالی‌ها جستجو نمود.

واژه­های کلیدی: گیلاس، اسید آبسیزیک، پیری، آلفامانوزیداز

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

1- مقدمه و كلیات………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-1- مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-2- اهداف…………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-3- فرضیه­ها………………………………………………………………………………………………………………… 4

2- سابقه تحقیق…………………………………………………………………………………………………… 6

2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس………………………………………………………………………………… 6

2-2- طبقه­بندی ارقام گیلاس……………………………………………………………………………………………. 7

2-3- کیفیت میوه…………………………………………………………………………………………………………….. 7

2-3-1- آنتوسیانین……………………………………………………………………………………………………. 7

2-3-2- اسیدیته………………………………………………………………………………………………………… 8

2-3-3- مواد جامد محلول………………………………………………………………………………………….. 8

2-3-4- سفتی بافت…………………………………………………………………………………………………… 9

2-3-5- کلروفیل و کاروتنوئید…………………………………………………………………………………….. 9

2-3-6- کربوهیدرات­ها……………………………………………………………………………………………. 10

2-4- بلوغ و رسیدگی در گیلاس……………………………………………………………………………………. 10

2-5- انبارمانی گیلاس…………………………………………………………………………………………………… 11

2-6- فیزیولوژی تنفس…………………………………………………………………………………………………… 12

2-7- اسید آبسیزیک……………………………………………………………………………………………………… 13

2-8- پیری……………………………………………………………………………………………………………………. 14

2-9- کنترل ژنتیکی متابولیسم گیاه…………………………………………………………………………………. 14

2-10- آنزیم آلفامانوزیداز و نقش آن در رسیدگی…………………………………………………………….. 15

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

3- مواد و روش کار…………………………………………………………………………………………………………….. 18

3-1- زمان و مکان آزمایش…………………………………………………………………………………………….. 18

3-2- بخش بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………………. 18

3-2-1- مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………. 18

3-2-2- طرح آماری آزمایش…………………………………………………………………………………….. 18

3-2-3- اندازه­گیری سفتی……………………………………………………………………………………….. 19

3-2-5- اندازه­گیری آنتوسیانین………………………………………………………………………………… 19

3-2-6- اندازه­گیری کلروفیل دم میوه………………………………………………………………………… 19

3-2-7- اندازه­گیری مواد جامد محلول میوه……………………………………………………………….. 21

3-2-8- اندازه­گیری اسیدیته قابل تیتراسیون میوه……………………………………………………….. 21

3-2-9- اندازه­گیری قند…………………………………………………………………………………………… 21

3-2-9-1- مواد مورد نیاز…………………………………………………………………………………… 21

3-2-9-2- استخراج قند…………………………………………………………………………………….. 22

3-2-9-3- اندازه­گیری قند کل……………………………………………………………………………. 22

3-2-9-4- منحنی استاندارد قند کل……………………………………………………………………. 23

3-2-9-5- اندازه­گیری فروکتوز………………………………………………………………………….. 23

3-2-9-6- تهیه نمودار استاندارد فروکتوز……………………………………………………………. 24

3-3- بخش بیوتکنولوژی……………………………………………………………………………………………….. 25

3-3-1- مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………. 25

3-3-2- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………. 25

3-3-3- طراحی آغازگرها………………………………………………………………………………………… 26

3-3-4- تکثیر قطعات انتخابی………………………………………………………………………………….. 27

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                              صفحه

3-3-5- ارزیابی محصول PCR به وسیله تکنیک الکتروفورز ژل آگارز…………………………. 28

3-3-6- توالی­یابی محصول PCR……………………………………………………………………………… 28

3-4- تجزیه و تحلیل آماری……………………………………………………………………………………………. 28

4- نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………………….. 30

4-1- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر سفتی میوه گیلاس…………………………….. 30

4-2- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر تغییرات آنتوسیانین میوه گیلاس…………. 33

4-3- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه گیلاس 36

4-4- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان مواد جامد محلول میوه گیلاس…… 42

4-5- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس 45

4-6- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان قند کل و فروکتوز میوه گیلاس….. 48

4-7- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 53

4-8- نتایج حاصل از طراحی آغازگر………………………………………………………………………………. 54

4-9- تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس………………………………………………………………. 54

4-10- بررسی نتایج حاصل از توالی­یابی و همردیف­سازی توالی­های بدست آمده……………….. 56

4-11- روابط فیلوژنی توالی­های مورد بررسی………………………………………………………………….. 60

4-12- نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………….. 61

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 62

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………. 64

مقدمه و كلیات

1-1- مقدمه

از دیرباز پدیده­ی عمر یکی از مسائل مهم حیات بوده است. از این­رو افزایش عمر برای موجودات گیاهی، جانوری و یا انسان می­تواند حائز اهمیت باشد.

پیری در گیاهان به عنوان مرحله­ی نهایی نمو تعریف شده است. از مشخصه­های بارز پیری کنترل روند تغییرات بسیار منظم و کنترل شده فعل و انفعالات فیزیولوژیکی است. از جمله مهمترین این رخدادها توقف فتوسنتز، تجزیه کلروپلاست، کاهش چشمگیر کلروفیل و شکستن پروتئین­ها و لیپید­ها و سایر مولکول­های بزرگ می­باشد (نواب پور و همکاران، 2003).

در میوه­های فرازگرا اتیلن عامل اصلی پیر شدن میوه می­باشد و کنترل اتیلن از مکانیسم­های اصلی جلوگیری از پیری در این میوه­ها است. اما گیلاس یک میوه­ی نافراز­گرا است. این میوه دارای ارقام متفاوتی از نظر طول عمر می­باشد که شناسایی عوامل دخیل در تعیین طول عمر در ارقام زودرس و دیررس می­تواند منجر به افزایش طول عمر گیلاس گردد.

طی رسیدن میوه، دسته­ای از فرآیندهای بیوشیمیایی که از لحاظ ژنتیکی در گیاه برنامه­ریزی شده­اند رخ می­دهد که باعث تغییر ویژگی­های میوه‌ی نارس و تبدیل آن به میوه‌ی رسیده می‌شود (برامل، 2006). همچنین بعد از برداشت محصولات، تغییرات مختلف ساختاری ادامه می­یابند که در جهت تخریب بافت میوه عمل می­کنند (یو و همکاران، 2003). نرم شدن بیش از حد میوه­ها مساله­ای است که عمر پس از برداشت آنها را کاهش می­دهد. در محصولات تراریخته با تغییر در بیان ژن پروتئین­ها و آنزیم­هایی که بر ویژگی­های دیواره­ی سلولی تاثیرگذار هستند، می­توان میزان فعالیت و تاثیر آنزیم­هایی مثل پلی گالاکتوروناز را در روند رسیدگی و نرم شدن محصول بررسی کرد (برامل و هارپستر، 2001 و واکابایاشی، 2000).

نرم شدن و تغییرات بافتی طی رسیدن میوه­ها در هر گونه­ی خاص، ویژگی­های مخصوص به خود را داراست (برامل و همکاران، 2004). علاوه بر این، تحقیقات نشان داده است که آنزیم­های آلفامانوزیداز (α-Man) و بتادی ان استیل هگزوسامینیداز (ß -Hex) در رسیدگی و نرم شدن میوه­های نافراز­گرا نقش دارند (قوش و همکاران، 2010).

با توجه به نافراز­گرا بودن میوه­ی گیلاس، مشخص نیست که بین ارقام زود­رس و دیر­رس این میوه چه بخشی از ژن­های α-Man و ß-Hex و ژن توسعه­ی سلولی (EXP) باعث تفاوت در طول عمر انباری گیلاس­های زود­رس و دیر­رس می­گردد. همچنین مشخص نمی­باشد که شاخص­های پیری بین دو رقم زود­رس و دیر­رس چه تفاوتی از نظر فعالیت­های آنزیمی α-Man و ß -Hex، لیپاز، پروتئاز و همچنین مقادیر قند، مواد جامد محلول،