1-3- هدف آزمایش…………………………………………………………………………………………………. 8

1-4-پرسش اصلی تحقیق (مساله تحقیق)……………………………………………………………………….. 9

فصل دوم: پیشینه تحقیق

2-1- حفظ انجمادی…………………………………………………………………………………………………. 11

2-1-1- کاربرد و فواید حفظ انجمادی منی…………………………………………………………………….. 11

2-1-2- انواع روش­های حفظ انجمادی…………………………………………………………………………. 12

2-1-3- تاریخچه حفظ انجماد منی قوچ ……………………………………………………………………….. 12

2-1-4- مراحل حفظ انجمادی منی……………………………………………………………………………… 14

2-2- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ………………………………………………………………………….. 15

2-2-1- رقیق کننده ها……………………………………………………………………………………………….. 15

2-2-3- مواد نگهدارنده یا محافظت کننده­ها……………………………………………………………………. 16

2-2-3-1- مواد نگهدارنده درون سلولی یا نفود کننده………………………………………………………… 16

2-2-3-2- مواد نگهدارنده برون سلولی یا نفود ناپذیر……………………………………………………….. 18

2-3-آشنایی اختصاری با سیستم آنالیز رایانه ای (CASA)…………………………………………………..

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- تجهیزات مورد نیاز برای جمع آوری، انجماد، ذوب و ذخیره منی و ارزیابی­های اسپرم………. 31

3- 2-آزمایش اول……………………………………………………………………………………………………. 31

3-3- آزمایش دوم…………………………………………………………………………………………………….. 31

3-4- حیوانات و جمع آوری منی…………………………………………………………………………………… 32

3-5- آماده سازی رقیق کننده­ها……………………………………………………………………………………. 32

3-6- رقیق سازی، انجماد و ذوب منی…………………………………………………………………………… 33

3-7- ارزیابی­های کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب…………………………………………….. 33

3-8- آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………………….. 35

فصل چهارم: نتـایج

4-1- نتایج……………………………………………………………………………………………………………… 38

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث…………………………………………………………………………………………………………….. 44

5- 2- نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………….   52

5-3- پیشنهادها ………………………………………………………………………………………………………. 54

منابع……………………………………………………………………………………………………………………… 55

چکیده:

فرایند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهش­دما به زیرصفر درجه سلسیوس، ذخیره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادی و بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث آسیب­های ساختاری و بیوشیمیایی به اسپرم می­شود که می­تواند زنده­مانی و باروری اسپرم را تحت تاثیرقرار دهد. هدف از این پژوهش، بررسی اثر سطوح مختلف لسیتین(5/0، 1، 5/1 و 2 %) و زرده تخم مرغ(10، 15، 17 و 20 %) در رقیق­کننده پایه تریس- فروکتوز (همراه با 5 درصد گلیسرول) پس­ازفرآیند انجمادو یخ‌‌گشایی بود. نمونه‌های منی توسط واژن مصنوعی از 4 راس قوچ افشاری بالغ، هفته­ای 2 بار جمع­آوری شد. نمونه­های منی رقیق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شد و سپس یخ­گشایی پایوت­های حاوی اسپرم در آب گرم 37 درجه سلسیوس انجام شد. تحرک­کل­وتحرک پیشرونده اسپرم با کمک سامانه آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازه­گیری شد. سلامت غشا، درصد اسپرم­های زنده و مورفولوژی اسپرم­ها بعد از فرایند یخ­گشایی اندازه­گیری شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که رقیق‌کننده حاوی 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ در مقایسه با سایر سطوح­های آزمایشی موجب بهبود معنی­دار­ در میزان تحرک­ کل، تحرک پیشرونده، یکپارچگی­غشا و اسپرم­های­زنده شد (01/0p < ). سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اثر معنی­داری روی مورفولوژی اسپرم­ها نداشتند (05/0p > ). مطابق با نتایج این پژوهش به نظر می‌رسد که افزودن 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ به رقیق‌کننده ­های انجماد اسپرم قوچ افشاری باعث بهبود معنی­دار فراسنجه­ های اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرم­های زنده میشود.

فصل اول: کلیات

1-1- پرورش گوسفند

پرورش گوسفند در ایران دارای قدمت تاریخی بسیار طولانی­می­باشد که هم اکنون ایران با داشتن 55 میلیون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده تولید مثلی و عدم استفاده از تلقیح مصنوعی در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادی خوبی از این صنعت به دست نیامده و رشد چندانی نکرده است. بنابراین این مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد منی قوچ با رقیق کننده­های بر پایه منشا گیاهی(لسیتین سویا) و حیوانی(زرده) برای بهبود کیفیت مناسب اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزیابی­عملکرد این رقیق کننده­ها با تست‌های­آزمایشگاهی مهم­مرتبط با توان باروری اسپرم صورت گرفت. نتیجه استفاده از این تست­ها، انتخاب رقیق کننده مناسب برای انجماد منی قوچ برای استفاده در تلقیح مصنوعی و انجام آسان برنامه­های اصلاح نژادی و در نهایت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادی بودن آن خواهد شد.

2-1- حفظ انجماد منی

حفظ انجماد منی و تلقیح مصنوعی فواید زیادی را برای صنعت پرورش حیوانات اهلی، به ویژه برای بهبود تولید مثلی و ژنتیکی­ارائه می­کنند. اما بزرگترین مانع در حفظ انجماد منی، آسیبی است که به ساختمان اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب وارد می­شود که منجر به باروری ضعیف اسپرم منجمد می­گردد (بارباس و همکاران، 2009). در طول سال­های اخیر، ابداع و توسعه­ی انواع رقیق کننده­های منی جهت انجماد اسپرم و در نتیجه افزایش راندمان و موفقیت تلقیح مصنوعی گسترش زیادی پیدا کرده است. لذا محققین مطالعات گسترده­ای برای تولید رقیق کننده­هایی که بتوانند باعث حفظ انجمادی اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترین مزایای منجمد کردن منی قوچ، می­توان به بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با استفاده از اسپرم قوچ­های با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقال­آسان منی­از مراکز تولید و جمع­آوری به دورترین دامداری­ها، انجام زایش­خارج از فصل تولید مثلی، جلوگیری از انقراض گونه­های در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، 2000).

در تحقیقات مرتبط با حفظ انجماد منی، بسیاری از مطالعات بر تشخیص آسیب­های وارد شده به اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب تمرکز نموده­اند(تریمچ و همکاران، 1997: مدیروس و همکاران، 2002). در حالی­که، مطالعات فراوان دیگری نیز به استفاده از محافظت کننده‌های مختلف در رقیق کننده منی برای جلوگیری یا کاهش این آسیب­ها، برای بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب تاکید کرده‌اند(تساک ماکدیس، 2010: فیزر و همکاران، 1984 ). بیشتر ارزیابی­های آزمایشگاهی که برای سنجش کیفیت منی استفاده می‌شود، همبستگی بالایی با توان باروری اسپرم ندارند. استفاده از رنگ­های فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری، تجزیه­و تحلیل گسترده­تری از پارامترهای اسپرم مانند زنده مانی، یکپارچگی­غشا و DNA، وضعیت آکروزوم، کروماتین­وظرفیت­دارشدن، عملکرد میتوکندری و تغییرات ساختاری (آپوپتوزیس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، 2001).

در بحث رقیق کننده منی برای جلوگیری بهتر از آسیب انجمادی[1] به کیفیت اسپرم، محافظت کننده­های انجمادی[2] مختلفی برای انجماد اسپرم در چند دهه گذشته استفاده شده است(کری و همکاران، 2000: واتسون، 1976). کیفیت اسپرم پس از ذوب، به دلیل وقوع شوک سرمایی و تنش اسمزی در طی فرآیند انجماد- ذوب کاهش می­یابد(سالامون و ویزر، 1972: بیلی و همکاران، 2000). بسیاری از این صدمات را می توان با رقیق کننده مناسب و مواد محافظ انجمادی مانع شد(گیل و همکاران، 200). ترکیبات موجود در رقیق کننده­ها باید بتوانند اسپرم را نسبت به شرایط متغیر بوجود آمده حفاظت نموده و حتی الامکان دچار صدمات کمتری کنند(هولت،