از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سایت برشی EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید  تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 كلون گردید به این ترتیب كه وكتور نوتركیب و نیز هر دو با آنزیم های NdeI-HindIII بریده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coli از طریق تکنیک های  SDS-PAGEو نیز وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.

مقدمه:

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکاینی پیش التهابی است كه در راه اندازی و تنظیم سیستم ایمنی ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب های بیماری زا از طریق فراخوانی نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α برای اولین بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس یا آندوتوكسین باكتری ها تیمار شده بودند جداسازی شد كه در مرگ سلول های توموری نقش ایفاء می كرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما این پلی پپتید 17 کیلودالتونی دارای عملكردهای متعددی نظیر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظیم خواب و رشد رویان می باشد.این فاكتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT  ی CD4+، لنفوسیت هایT  ی CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بیان می شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نیز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروكاریوتی در كشور می تواند باعث فراهم شدن زمینه جهت انجام تحقیقات بعدی نظیر تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نیز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­ های دارویی

بیوتکنولوژی (زیست فناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­ کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزی نظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی  DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917 توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارائه دادند و در سال 1976 اولین شركت مستقل بیوتكنولوژی،­Genentech، به منظور تجاری كردن این تكنولوژی جدید تاسیس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با بهره گرفتن از تكنولوژی DNA نوتركیب برای نخستین بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002). پیش از بکار بردن روش های بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روش های خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است، بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).

در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).

تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکیب بهره می­گیرد. هدف نهایی بیوتکنولوژی دارویی ژن درمانی و ورود مواد ژنتیکی به سلول­ها برای جلوگیری یا کنترل و یا معالجه بیماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.

2-1- کلون کردن ژن

كلون كردن عبارت است از به وجود آوردن نسخه کاملاً مشابه یك قسمت كوچكی از DNA، سلول و یا موجود كامل. كلون كردن ژن تحت عناوین كلون كردن مولكولی و تكنولوژی DNA نو­تركیب نیز شناخته می­شود(Brown 1996). در این تکنیک یك توالی ژنی را جدا كرده و با آنزیم اختصاصی برش می­دهند. سپس با بهره گرفتن از آنزیمDNA  لیگاز[1] DNA مورد نظر در یك وكتور مناسب قرار داده می­شود. هیبرید حاصله را Construct DNA گویند. که با انتقال به باکتری و یا سلول میزبان امکان تکثیر آن فراهم می­شود(Maeyer and De Maeyer-Guignard, 1998). در سال 1973، نخستین DNA نو­ترکیب با بهره گرفتن از آنزیم­های برشی و آنزیم لیگاز در دانشگاه Stanford آمریکا ساخته شد.

کشف تکنولوژی DNA نو­ترکیب سر­آغاز پیشرفت­های جدید در علوم و بیوتکنولوژی شد. یکی از خصوصیات مهم ژن کلون شده در تکنولوژی DNA نو­ترکیب، این است که اغلب می ­تواند درون موجودی دیگر که کاملاً متفاوت با موجود اولیه است، فعالیت خود را انجام دهد(Michael and et., 1982). اهمیت اصلی كلون كردن ژن به دست آوردن مقادیر كافی از ژن­های مورد نظر برای تجزیه و تحلیل بعدی است و امكان آزمایشات ژنتیكی برای فهم مكانیسم­های دخیل در بیماری­های ژنتیكی و در نتیجه پیدا كردن راهكارهای مناسب برای تشخیص و درمان آنها را فراهم می­آورد. كلون كردن ژن همچنین در داروسازی امروزه برای ساخت داروها با ساختار پروتئین نقش اساسی دارد. در حال حاضر یکی از مهمترین راهکارهای استفادة درمانی از این فناوری در توسعة روش­های درمانی نوین از جمله   ژن درمانی است.

1-2-1- ابزار و عوامل کلون کردن ژن

همانطور که قبلاً ذکر شد اساس کلون کردن، برش دادن مولکول­های متفاوت DNA و اتصال دوبارة آنها است. برای این کار ابزارهای مولکولی لازم است که مهمترین آنها آنزیم­های محدود کننده[1] و آنزیم لیگاز هستند.

1-2-1-1- آنزیم­های برشی

در كلون كردن ژن، برای ایجاد یك مولكول  DNAی نو­تركیب، ناقل بایستی به صورت کاملاً دقیق در یك نقطه مشخص(با امكان اتصال و برش دوباره) برش داده شود تا قطعه DNA كه قرار است، کلونپ شود، در آن نقطه وارد گردد. اندونوكلئاز­های برشی، آنزیم­هایی هستند كه قطعه DNA را در مكان­های اختصاصی برش می­دهند. اولین آنزیم برشی در سال 1970 از باكتری Haemophilus influenzae جداسازی شد. انواع مختلف باکتری­ها انواع متفاوتی از این آنزیم­ها را تولید می­ کنند. به همین دلیل اسامی آنها معمولاً از نام باکتری­های مولد آنها مشتق شده است(McDonald, 1996).

1-2-1-2- آنزیم DNA لیگاز

یكی از آنزیم­های مهم در سلول برای اتصال قطعات، DNA لیگاز نامیده می­شود که موجب بازسازی پیوندهای فسفودی­استری از هم گسیخته می­گردد. هر گاه  DNAی ناقل و  DNAی خارجی هر دو با یك آنزیم برشی بریده شوند، نواحی انتهایی متناظر در ناقل و  DNAی خارجی با یكدیگر سازگار بوده و مكمل یكدیگرند. و توالی­های تك رشته­ای انتهاهای مكمل با هم جفت می­شوند. لیگاز­ها روی قطعات برخوردار از گروه فسفات در انتهای ‘5 عمل كرده و با ایجاد پیوند فسفودی­استری سبب بر­قراری اتصال بین دو توالی DNA می­شوند، این فرایند كه به اتصال[1] معروف است، آخرین مرحله ساخته شدن یك مولكول  DNAی نو­تركیب است.

در کلون کردن ژن­ها نوع آنزیمی كه معمولاً مورد استفاده قرار می­گیرد، DNA لیگاز T4 است كه از باكتری­های E. coli آلوده شده با باكتریوفاژ T4 به دست می­آید. زیرا این آنزیم هم قادر به اتصال رشته های  DNAی دو رشته­ای با انتهای صاف و هم با انتهای چسبان می­باشد در حالی كه DNA لیگاز باكتری E. coli در اتصال قطعات با انتهای صاف ناتوان است. دمای بهینه فعالیت هر دو آنزیم در سیستم بیولوژیكی 37 درجه است. ولی از آنجا كه برای اتصال قطعات جدا از هم و مكمل تشكیل اولیه پیوندهای هیدروژنی بین نوكلئوتیدهای مكمل ضروری است و در واكنش درون شیشه­ای[2] پیوندهای هیدروژنی، پایداری چندانی در مقابل دمای بالا ندارند به همین دلیل این نوع واكنش­ها در دماهای پایین 16-4 درجه سانتیگراد و به مدت طولانی انجام شود(McDonald, 1996).

1-2-2- وکتورهای کلونینگ

برای این كه بتوان قطعه­ای از  DNAی دلخواه (موسوم به Insert DNA) را با بهره گرفتن از شرایط طبیعی (in vitro) تكثیر كرده و برای مطالعات بیشتر استفاده نمود، لازم است DNA را توسط مولكول­های وکتور به سلول­های مورد نظر انتقال داد. در غیر این صورت، عمل انتقال، تكثیر و یا استخراج  DNAی مورد نظر امكان­پذیر نمی­شود. نظر به این كه قطعات تكثیر شده همه با هم یكسان هستند، این نوع متدولوژی به همسانه­سازی DNA موسوم است. مولكول­های وکتور DNA (DNAVector) كه خود DNA می­باشند، بنا به داشتن توالی به خصوصی قادر هستند در سلول­های میزبان خود به تعداد زیادی تكثیر شوند. در این صورت قطعه  DNAی دلخواه نیز به همراه وکتور خود تكثیر می­شود.

وكتورهای DNA تنوع بسیار زیادی دارند. مهمترین عامل طبقه ­بندی آنها میزان ظرفیت حمل DNA به سلول میزبان است. قطعات DNA را می­توان از چند نوكلئوتید گرفته تا بیش از صد هزار نوكلئوتید توسط وكتورهای مناسب همسانه­سازی نمود. به همین دلیل در طراحی اولیه باید ابتدا اندازه  DNAی مورد نظر را مشخص و وكتور مناسبی انتخاب نمود. پلاسمیدها، فاژ λ، کاسمید و کروموزوم­های مصنوعی مخمر(Yeast artification chromosom) از وکتورهایی هستند که بیش از سایر وکتورها مورد استفاده قرار می­گیرد(Larry and Champness, 2007).

مشخصات كلی وكتورهای كلونینگ

وكتورهای مختلف DNA با تنوع بسیار زیاد، شامل اندازه­ها و ظرفیت­های حمل مختلف موجود می باشند، ولی دارای نقاط مشترك اساسی ذیل هستند:

مبدا همانند­سازی[1]

همه وكتورها دارای توالی­های ویژه­ای هستند كه توسط آنزیم DNA پلی­مراز سلول میزبان شناسایی شده و به تعداد بسیار زیادتر از ژنوم خود میزبان تكثیر می­شوند این توالی به مبدا همانند­سازی موسوم است و با Ori نشان داده می­شود. برخی وکتورها حاوی دو نوع Ori برای تكثیر در دو نوع سلول میزبان می باشند. همانند­سازی وكتور توسط DNA پلی­مراز سلول میزبان، در این ناحیه شروع و در دو جهت (Bi-directional) مخالف هم ادامه می­یابد.

نشانگرهای انتخابی[2]

همه وكتورها حامل ژن­هایی هستند كه به واسطه ایفایش آنها می­توان وجود وكتور را به سهولت در داخل سلول میزبان ردیابی نمود. متداول­ترین نشانگرها، ژن­هایی هستند كه فرآورده آنها باعث بروز مقاومت در برابر آنتی­بیوتیك­های به خصوصی می­شود. در صورتی كه وكتور به داخل سلول میزبان حساس به یك آنتی­بیوتیك انتقال یابد، می ­تواند در حضور همان آنتی­بیوتیك زنده مانده و رشد كند. انواع نشانگرهای رایجی كه مقاومت به آنتی­بیوتیك به خصوصی را در سلول میزبان القاء می­كنند، آمپی سیلین[3]، تتراسایكلین[4]، جنتامایسین[5]، كانامایسین[6] و استرپتومایسین[7] می­باشند.

نشانگرهای ژنتیکی[8]

دسته دیگری از نشانگرها، ژن­هایی هستند كه عامل كنترل یك سری واكنش­های بیوشیمیایی هستند. و در حضور مواد زمینه خاصی واكنش­های به خصوصی را بر­می­انگیزند. مثلاً ژن LacZ كه استفاده از آن بسیار متداول می­باشد در صورت انتقال به سویه­ای از باكتری E. coli كه این ژن را ندارد باعث تولید آنزیم بتا-گالاكتوزیداز می­شود كه می ­تواند روی ماده­ای بنام X-Gal اثر کرده و رنگ آبی در محیط اطراف سلول تولید کند. برای تشخیص اینكه سلول میزبان حاوی وکتور DNA است، استفاده از یك نوع نشانگر كافی است ولی برای اینكه بتوان ماهیت وکتور را در رابطه با حامل بودن DNA وارد شده بررسی نمود، استفاده از نشانگرهای ثانوی ضروری می­باشد.

جایگاه کلونینگ متعدد[9] (MCS)

برای اینكه بتوان DNA وارد شده را با بهره گرفتن از مكانیسم نوتركیبی[10] وارد قسمت خاصی از  DNAی وکتور کرد، در ساده­ترین روش كار لازم است با بهره گرفتن از آنزیم­های برش دهنده هر دو DNA را برش داده و قطعات برشی و سپس دو نوع DNA را به هم اتصال داد در وکتورهای جدید جایگاه کلونینگ یا MCS شامل توالی­هایی است كه حاوی توالی­های شناسایی و جایگاه برش برای آنزیم­های برش دهنده متعدد می­باشد. در کلونینگ باید از آنزیم­هایی استفاده كرد كه فقط می­توانند یكبار DNA وکتور را مورد برش قرار دهند به همین دلیل این جایگاه­ها را جایگاه برشی منحصر به فرد می­نامند. بنابر این MCS هر وکتور جایگاه برشی آنزیم­هایی را ارائه می­كند كه در تمامی طول وکتور منحصر به فرد[11] هستند. اگر­چه وجود MCS در یك وکتور الزامی است اما این جایگاه باید در مكان ویژه­ای در روی وکتور قرار گرفته باشد به طور رایج این محل در ناحیه ´5 ژن LacZ قرار دارد كه وجود آن در این محل در تولید فرآورده این نشانگر اختلالی ایجاد نمی­كند در صورت وارد كردن DNA در جایگاه MCS توالی این ژن مختل شده و عدم تولید كلونی­های آبی رنگ در حضور X-Gal وجود  DNAی وارد شده را نشان می­دهد.

جایگاه ­های پروموتر[12]

بسته به هدف کلونینگ، وكتورهای متفاوتی طراحی شده ­اند و به منظور انجام عملیات مختلف، توالی­های ویژه­ای در یك یا دو ردیف MCS قرار داده شده­اند. این توالی­های الیگو­نوكلئوتیدی محل شناسایی و كنترل آنزیم­های مختلف از منابع متفاوت هستند كه در سویه­های مختلفE. coli  موجود می­باشند. به این ترتیب بایستی برای اهداف و عملیات بخصوص، وكتور و سویه باكتری مناسب و سازگاری را انتخاب نمود. ممكن است هدف از کلونینگ تولید و تكثیر DNA هدف، تولیدmRNA  از  DNAی هدف یا این كه تولید فرآورده پروتئینی کد شونده از  DNAی هدف باشد. وجود پروموترهای ویژه و آنزیم­های مربوطه انجام این نوع عملیات را بر­عهده دارند.

مثلاً RNA polimerase از باكتریوفاژهای مختلف کلون شده و سویه­های ترا­ریخته E. coli حاوی این ژن­ها می­باشند. این نوع پلی­مرازها از  DNAهایی كه در مجاورت توالی پروموتور مخصوص شان قرار داشته باشند، به تعداد زیادی نسخه­برداری كرده و mRNA ی زیادی تولید می­شود. این نوع وكتور به وکتور نسخه­برداری موسوم است.

در صورتی كه تولید مقادیر زیادی از پروتئین کد شونده توسط  DNAی هدف مد نظر باشد، توالی­هایی مربوط به پروموتر در ابتدای  DNAی هدف قرار می­گیرد كه با بر هم كنش با ریبوزوم­ها و فاكتورهای تولید پروتئین در سلول، باعث بالا رفتن میزان تولید پروتئینی می­شود كه به هیچ نحو مورد نیاز و استفاده باكتری نیست. این نوع وكتورها نیز به وکتور بیانی [13]موسوم هستند (محمود­پور،1381).