پروتئازهای میکروبی در بین مهم‌ترین آنزیم‌های هیدرولیز‌کننده قرار‌دارند که حدود %60 از بازار جهانی آنزیم‌های صنعتی را به خود اختصاص داده‌اند. در این پژوهش، ستنز آنزیم پروتئاز در فرآیند تخمیر حالت جامد با بهره گرفتن از باکتری Bacillus. licheniformis مورد بررسی قرار‌گرفت. ضایعات و محصولات مختلف کشاورزی شامل سبوس گندم، سبوس برنج، باگاس، پوسته ذرت، آرد‌ذرت و آرد‌جو بعنوان سوبسترا مورد استفاده قرار‌گرفتند. پروتئاز تولیدی از پوسته گندم نسبت به بقیه سوبسترا فعالیت بیشتری نشان داده است. اثر پارامترهای مختلف استخراج شامل نوع و مقدار محلول استخراج کننده و زمان اقامت در شیکر مورد ارزیابی قرار‌گرفت. بیشترین میزان بازیابی پروتئاز با بهره گرفتن از 50 میلی‌لیتر بافر تریس پس از طی مدت 1 ساعت در شیکر بدست آمد. علاوه بر این، تأثیر پارامترهای عملیاتی چون زمان، دما، pH، رطوبت ابتدایی، رطوبت کابین، اندازه ذرات و میزان مایه تلقیح بر تولید آنزیم مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان فعالیت آنزیم پروتئاز پس از 48 ساعت تخمیر، در دمای Cº 35 ، pH ابتدایی برابر 9، رطوبت کابین %90، اندازه ذرات در محدوده cm 2-1 و رطوبت اولیه %200 برای سینی بالایی و %150 برای سینی میانی بدست آمد. همچنین تأثیر مکمل‌های مختلف کربنی و نیتروژنی بر تولید پروتئاز بررسی‌شد. نتایج نشان‌داد که با غنی‌سازی سوبسترا با سبوس برنج (w/w %1) و آرد ذرت ( w/w%2)، بیشترین فعالیت آنزیم پروتئاز بدست‌آمد. حداکثر فعالیت پروتئاز پس از گذشت 48 ساعت، تحت تمامی شرایط مطلوب، میزان فعالیت U/gds 1/1281 و U/gds 7/1048 به ترتیب برای سینی بالایی و میانی بدست آمد. تأثیر دما و pH بر فعالیت و پایداری آنزیم مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که پروتئاز تولیدی ماهیت قلیایی داشته و پایداری بسیار قابل توجهی در محدوده تغییرات دما در بازه Cº 85-30 و مقادیر pH بین 13-7 داشته است و بیشترین فعالیت در مقدار pH برابر 8 و دمای Cº65 حاصل شده است. همچنین کاربرد آنزیم تولیدی در پردازش چرم و هیدرولیز لایه ژلاتین از فیلم‌های عکاسی و همچنین به عنوان افزودنی به شوینده، مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که پروتئاز قلیایی حاصل از B. licheniformis قابلیت بسیار خوبی در حذف لکه‌های مختلف از پارچه، موزدایی از پوست گاو و هضم لایه ژلاتینی از فیلم‌های عکاسی از خود نشان داد. همچنین، تولید آنزیم پروتئاز با بهره گرفتن از فرآیند تخمیر حالت جامد در بیوراکتور و فلاسک بررسی و دو سامانه از نظر میزان تولید آنزیم با یکدیگر مقایسه شدند.

واژه‌های كلیدی: پروتئاز، سبوس گندم، تخمیر حالت جامد، بیوراکتور سینی‌دار، Bacillus. licheniformis

فهرست مطالب

فصل1  1

مقدمه  1

1-1. مقدمه 2

1-2. تعریف آنزیم 2

1-3. تاریخچه آنزیم 2

1-4. ساختار آنزیم 4

1-5. تقسیم‌بندی آنزیم‌ها 5

1-6. تاریخچه آنزیم پروتئاز. 6

1-7. عملکرد پروتئازها 6

1-8. تخمیرحالت جامد 7

1-9. ضرورت انجام پروژه 8

1-10. اهداف این پروژه 8

فصل2 مروری بر منابع مطالعاتی  10

2-1. مقدمه 11

2-2. پروتئازها 11

2-3. منابع پروتئازها 12

2-3-1. پروتئازهای گیاهی. 12

2-3-2. پروتئازهای حیوانی. 13

2-3-3. پروتئازهای میکروبی. 13

2-4. تقسیم بندی پروتئازها 16

2-5. پروتئازهای قلیایی. 19

2-6. مکانیزم عمل پروتئازها 22

2-7. کاربردهای صنعتی آنزیم پروتئاز. 22

2-7-1. صنعت مواد شوینده 23

2-7-2. صنایع غذایی. 24

2-7-3. صنعت چرم 25

2-7-4. صنعت عکاسی. 26

2-7-5. صنایع دارویی. 26

2-7-6. مدیریت محیط زیست.. 27

2-8. تولید آنزیم پروتئاز. 27

2-9. تخمیر حالت غوطه ور. 28

2-9-1. تخمیر حالت جامد 29

2-9-2. مقایسه سیستم‌های تخمیر جامد و غوطه‌ور. 29

2-9-3. انتقال جرم در تخمیر حالت جامد 30

2-9-4. عملیات انتقال جرم در مقیاس ماکرو. 31

2-9-5. عملیات انتقال جرم در مقیاس میکرو. 32

2-9-6. انتقال اکسیژن. 32

2-9-7. نفوذ آنزیم‌ها 33

2-9-8. جنبه‌های انتقال حرارت.. 34

2-9-9. میکروارگانیزم‌های مورد استفاده در تخمیر حالت جامد 35

2-9-10. کاربردهای تخمیر حالت جامد 37

2-9-11. آنزیم‌های بدست آمده از فرآیند تخمیر جامد 38

 

2-10. طراحی بیوراکتور. 39

2-11. انواع بیوراکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد 40

2-11-1. بیوراکتورهای سینی‌دار. 41

2-11-2. بیوراکتورهای بستر‌پرشده 42

2-11-3. بیوراکتورهای استوانه ای‌دوار. 43

2-11-4. بیوراکتورهای بستر‌سیال. 45

2-12. مراحل عمومی برای انجام فرآیند SSF در داخل بیوراکتور. 46

2-13. عوامل مؤثر در تولید پروتئاز در فرآیند SSF در داخل بیوارکتور. 47

فصل3 مواد و روش‌ها 48

3-1. مقدمه 49

3-2. تجهیزات مورد استفاده 49

3-3. تعیین مشخصات سوبسترا 50

3-3-1. محاسبه میزان خاکستر. 50

3-3-2. محاسبه میزان رطوبت.. 51

3-3-3. محاسبه میزان قند موجود در سوبسترا 51

3-3-4. محاسبه میزان پروتئین. 52

3-3-5. تعیین درصد مواد استخراجی. 54

3-3-6. تعیین درصد سلولز. 54

3-3-7. تعیین درصد لیگنین. 55

3-3-8. تعیین درصد همی‌سلولز. 55

3-3-9. محاسبه اندازه ذرات سوبسترا 55

3-4. میکروارگانیسم و محیط کشت.. 56

3-4-1. انتخاب میکروارگانیسم 56

3-4-2. مشخصات میکروارگانیسم 57

3-4-3. محیط کشت.. 57

3-4-4. تهیه مایه تلقیح. 59

3-4-5. منحنی رشد باکتری. 60

3-4-6. تعیین pH بهینه باکتری. 60

3-5. تخمیر حالت جامد 61

3-6. نمونه‌گیری و استخراج آنزیم از سوبسترای تخمیر‌یافته 63

3-7. فعالیت پروتئاز. 64

3-7-1. منحنی استاندارد تیروزین. 65

3-8. بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر روی تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینی‌دار  66

3-8-1. تأثیر نوع سوبسترای جامد 66

3-8-2. تأثیر مدت زمان تخمیر. 67

3-8-3. اثر دما 67

3-8-4. تأثیر pH. 67

3-8-5. اثر پارامترهای مختلف بر روی استخراج آنزیم 68

3-8-6. تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا 68

3-8-7. تأثیر رطوبت داخلی راکتور. 68

3-8-8. تأثیر اندازه ذرات.. 68

3-8-9. تأثیر میزان تلقیح. 69

3-8-10. تأثیر غنی‌سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی. 69

3-8-11. تأثیر pH بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی. 69

3-8-12. تأثیر دما بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی. 70

3-9. کاربردهای آنزیم تولیدی. 71

3-9-1. افزودنی به مواد شوینده 71

3-9-2. پردازش چرم 71

3-9-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های عکاسی و آزاد سازی نقره 72

3-10. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 72

فصل4 نتایج و تفسیر آنها 73

4-1. مقدمه 74

4-2. محاسبه خصوصیات سبوس گندم 74

4-3. منحنی رشد باکتری. 75

4-4. pH بهینه رشد باکتری. 75

4-5. بررسی پارامترهای مختلف بر تولید پروتئاز. 76

4-5-1. تأثیر مدت زمان تخمیر. 76

4-5-2. بررسی تأثیر نوع سوبسترای جامد 78

4-5-3. بررسی پارامترهای مؤثر بر استخراج پروتئاز. 79

4-5-4. تأثیر pH ابتدایی. 82

4-5-5. بررسی دمای داخل بیوراکتور. 82

4-5-6. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا 84

4-5-7. تأثیر رطوبت داخلی بیوراکتور. 85

4-5-8. تأثیر اندازه ذرات.. 86

4-5-9. تاثیر میزان مایه تلقیح. 87

4-5-10. بررسی تأثیر غنی سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی. 87

4-6. بهینه سازی شرایط فعالیت پروتئازی آنزیم 92

4-6-1. تعیین pH بهینه فعالیت آنزیم 92

4-6-2. تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم 94

4-6-3. تعیین pH پایداری آنزیم 95

4-6-4. تعیین دمای بهینه پایداری آنزیم 96

4-7. کاربردهای آنزیم پروتئاز قلیایی حاصل از B.licheniformis 97

4-7-1. عملکرد پروتئاز قلیایی به عنوان افزدونی به شوینده 97

4-7-2. موزدایی از پوست.. 98

4-7-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های X-Ray. 99

4-8. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 100

فصل5 نتیجه‌گیری و پیشنهادها 103

5-1. نتیجه‌گیری. 104

5-2. پیشنهادها 106

فهرست اشکال

فصل1  1

مقدمه  1

شکل1-1. مکانیزم اثر آنزیم بر روی انرژی واکنش.. 3

شکل1-2. شماتیکی از مدل‌های ارائه شده برای جایگاه فعال آنزیمی، (1): مدل قفل و کلید، (2): مدل القایی  4

شکل1-3. نقش پروتئازها در کاتالیز کردن پیوندهای پپتیدی.. 7

فصل2 مروری بر منابع مطالعاتی  10

شکل2-1. ارتباط فرآیندهای میکرو و ماکرو در فرآیند تخمیر حالت جامد 32

شکل2-2. بیوراکتور سینی‌دار. 42

شکل2-3. بیوراکتور بسترپرشده بصورت افقی و عمودی.. 43

شکل2-4. بیوراکتور استوانه ای‌دوار. 44

شکل2-5. بیوراکتور بستر‌سیال. 45

فصل3 مواد و روش‌ها 48

شکل3-1. منحنی استاندارد گلوکز. 52

شکل3-2. منحنی استاندارد پروتئین. 53

شکل3-3. تصویر میکروسکوپی از باکتری B. licheniformis 56

شکل3-4. نمایی از بیوراکتور مور استفاده جهت تولید پروتئاز در تخمیر حالت جامد 62

شکل3-5. دیاگرام شماتیک بیوراکتور سینی‌دار. (1) پمپ، (2) نمایشگر و کنترلر دما و رطوبت، (3) نازل                                                                                                  (4) المنت حرارتی، (5) سینی، (6) فن، (7) حسگر دما، (8) حسگر رطوبت.. 63

شکل3-6. نمونه 5گرمی سوبسترای تخمیریافته، (1) : قبل از تخمیر، (2): پس از تخمیر. 64

شکل3-7. منحنی استاندارد تیروزین. 66

فصل4 نتایج و تفسیر آنها 73

شکل4-1. منحنی رشد باکتری.. 75

شکل4-2. تأثیر زمان تخمیر بر روی فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 77

شکل4-3. تأثیر زمان تخمیر بر روی محتوای پروتئین کل. 78

شکل4-4. تأثیر نوع سوبسترای جامد بر فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 79

شکل4-5. تأثیر محلول های مختلف بر استخراج پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 80

شکل4-6. تأثیر حجم بافر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 81

شکل4-7. تأثیر زمان اقامت در شیکر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 81

شکل4-8. اثر pH ابتدایی بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 82

شکل4-9. تأثیر دمای داخل بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 83

شکل4-10. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 84

شکل4-11. اثر رطوبت داخلی بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 85

شکل4-12. تأثیر اندازه ذرات سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 86

شکل4-13. تأثیر میزان مایه تلقیح بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 87

شکل4-14. تأثیر منابع کربنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 89

شکل4-15. تأثیر غلظت های مختلف سبوس برنج بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 89

شکل4-16. تأثیر منابع نیتروژنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 91

شکل4-17. تأثیر غلظت های مختلف آرد ذرت بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 91

شکل4-18. تأثیر pH بر فعالیت آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 93

شکل4-19. اثر دما بر فعالیت آنزیم پروتئاز. 94

شکل4-20. اثر pH بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 95

شکل4-21. اثر دما بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 96

شکل4-22. اثر زمان بر پایداری حرارتی آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 97

شکل4-23. عملکرد پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis بعنوان افزودنی به شوینده، (1) کنترل،                                               (2) اثر شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده، (3) اثر آنزیم و شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده 98

شکل4-24. موزدایی آنزیمی از پوست گاو با بهره گرفتن از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis                                               (1) کنترل (2) نمونه پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق. 98

شکل4-25. هیدرولیز آنزیمی لایه ژلاتینی با بهره گرفتن از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis..                                            (1) کنترل، (2) فیلم عکاسی پس از هیدرولیز آنزیمی. 99

شکل4-26. تأثیر زمان بر تولیدآنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 101

شکل4-27. تأثیر دما بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 101

شکل4-28. تأثیر رطوبت ابتدایی بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 102

شکل4-29. تأثیر محرک‌های پروتئینی مختلف بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک… 102

فصل5 نتیجه‌گیری و پیشنهادها 103

فهرست جداول

فصل1  1

مقدمه  1

جدول1-1. گروه‌‌های آنزیمی و واکنش‌های مرتبط. 5

فصل2 مروری بر منابع مطالعاتی  10

جدول2-1. پروتئاز‌های قلیایی باکتریایی تجاری، شرکت تولید کننده، منابع و کاربردهای صنعتی  15

جدول2-2. برخی از خواص کارلسبرگ و BPN. 19

جدول2-3. دمای بهینه و پایداری حرارتی پروتئازهای قلیایی حاصل از گونه های باسیلوس.. 20

جدول2-4. pH بهینه پروتئازهای قلیایی تولید شده توسط گونه باسیلوس.. 21

جدول2-5. میکروارگانیسم‌های مورد استفاده در فرآیندهای تخیمری حالت جامد 36

جدول2-6. کاربردهای تخمیر حالت جامد 37

جدول2-7. آنزیم‌های تولید شده در فرآیند تخمیر حالت جامد 38

جدول2-8. انواع بیوراکتورها در فرآیند تخمیر جامد و محصولات تولیدی.. 46

فصل3 مواد و روش‌ها 48

جدول3-1. ترکیب محیط کشت مایع. 58

جدول3-2. ترکیبات مایه تلقیح. 60

فصل4 نتایج و تفسیر آنها 73

جدول4-1. خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سبوس گندم 74

جدول4-2. pH بهینه رشد باکتری.. 76

جدول4-3. تأثیر سبوس برنج (1%) و آرد ذرت (2%) بر تولید پروتئاز در بیواکتور سینی دار. 92

فصل5 نتیجه‌گیری و پیشنهادها 103

فهرست علائم اختصاری