1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیتها 7
1-2-5- استرس اکسیداتیو. 8
1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو. 8
1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو. 9
1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA… 9
1-2-6-1-2- اهمیت سلامت DNA اسپرم. 11
1-2-6-2-استرس اکسیداتیو در اسپرم. 12
1-2-6-3- استرس اکسیداتیو و بیماریهای دیگر. 12
1-2-7- اثراتROS.. 13
1-2-7-1- پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم. 13
1-2-7-2- اثر روی تحرک اسپرم. 13
1-2-8- ROS و استرس اکسیداتیو مایع منی.. 13
1-2-9- ROS و ناباروری.. 14
1-2-10- آنتی اکسیدانها 15
1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتیاکسیدانها به دو روش طبقه بندی میشود: 16
1-2-11- اثرات آنتیاکسیدانها 18
1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم. 18
1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیبهای بعد از انجماد اسپرم. 18
1-2-11-3- تاثیر آنتیاکسیدانها در جلوگیری از آسیب بهDNA… 18
1-2-12- نقش آنتیاکسیدانها (ربایندههایبالقوهROS) دراسپرم. 19
3-1- ژنتیک و ناباروری مردان.. 20
1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه. 21
1-4- اهداف: 22
1-5-فرضیات: 22
فصل دوم مروری بر مطالعات گذشته24
فصل سوم مواد و روشها
3-1- تعیین گروههای آزمایشی.. 30
3-2- جمع آوری نمونهها و محل انجام آزمایش…. 30
3-3- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP.. 31
3-4- تک سلول کردن بافت بیضه. 31
3-5- شمارش تعداد سلولهای زنده در بافت بیضه. 32
3-6-1- روش فلوسایتومتری.. 32
3-6-2- سنجش ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری.. 34
3-7- روشهای تعیین آسیب DNA اسپرم. 35
3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست DNAاسپرم. 36
3-7-2- جمع‌آوری سلولهای اسپرمی جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم. 37
3-7-3- محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت روش TUNEL، به منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم. 39
3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL.. 39
3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL.. 40
3-8- بررسی بیان ژن Kdm5d یا Smcy. 40
3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول.. 41
3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 42
3-8-3- تیمار کردن نمونههای RNAی استخراج شده 43
3-8-4- سنتزDNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA… 44
3-8-5- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA… 46
3-8-6-روش تهیهی ژل آگارز و انجام الکتروفورز 48
3-8-7- طرز تهیهی محلولها 48
1- بافر50x TAE.. 48
2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml) 48
3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با استفاده از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته. 49
3-8-8-1-روش Ct مقایسهای برای کمی سازی نسبی.. 50
3-8-6- آنالیز آماری.. 52
فصل چهارم نتایج
4-1- بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54
4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه. 55
4-3- بررسی میزان ROS در بیضهی گروه کنترل و آزمون.. 56
4-3-1- اندازه گیری میزان O2 و H2O2 56
4-4- نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL.. 59
4-5- بررسی وضعیت بیانی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 61
4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه. 61
4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA… 62
4-5-3- بررسی بیان کمی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 63
فصل پنجم بحث و نتیجهگیری
5-1- بحث و نتیجه گیری کلی.. 67
5-2- پیشنهادات: 70
منابع.. 71
خلاصه انگلیسی… 80
ضمائم.. 81
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1: انواع آنتیاکسیدانها و مکانیسم عملکرد آنها 17
جدول 3-1: ترکیب محیط TCM…. 38
جدول 3-2: ترکیب محیط 38
جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده 40
جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونههایRNA… 43
جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA… 45
جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA… 45
جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR… 47
جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکلهای هر مرحله. 47
جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واكنش Real-Time PCR… 51
جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR… 51
جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54
جدول 4-2: میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونههای بیضهای با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری.. 58
جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون.. 60
جدول 4-4: دادههای گزارش شده برای آنالیز کمی ژن Kdm5d.. 64
جدول 4-5: آنالیز نتایج Real-Time PCR با استفاده از نرم افزار REST.. 64
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-1: ارتباط بین ATMو P53 در پاسخهای ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو. 9
شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری.. 15
شکل 1-3: فشردگی کروماتین قبل از ورود به میوز توسط کمپلکس Smcy-MSH5.. 21
شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار 32
شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن.. 34
شکل 3-3: روشهای ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آنها 36
شکل3-4: اساس روش TUNEL.. 37
شکل 4-1: نمونههای بافت بیضه در موشهای کنترل و آزمون.. 56
شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت(1000×) 60
شکل 4-3: نمونه RNAهای استخراج شده از بافت بیضه. 62
شکل 4-4: محصولات RT-PCR. 63
شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه. 65
فهرست نمودار
عنوان صفحه
نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون. 55
نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلولهای بیضهای در یکی از نمونههای گروه کنترل و آزمون.. 57
نمودار 4-3: نتیجه حاصل از بررسی میزان ROS (H2O2 و ̊O2) در نمونههای بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون 59
نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونههای اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون 61
|
[جمعه 1398-07-05] [ 11:26:00 ب.ظ ]
|
